ORDIN
Nr. 147 din 10 aprilie 2002
pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind stabilirea protocoalelor de
testare si conditiile de autorizare a targurilor de animale, fermelor de
carantina sau centrelor de colectare in cazul importurilor de animale vii din
speciile bovine si porcine provenite din tari terte
ACT EMIS DE: MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTATIEI SI PADURILOR
ACT PUBLICAT IN: MONITORUL OFICIAL NR. 659 din 5 septembrie 2002
Ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor,
in temeiul prevederilor art. 31 alin. 1 din Legea sanitara veterinara nr.
60/1974, republicata, cu modificarile si completarile ulterioare,
in baza Hotararii Guvernului nr. 12/2001 privind organizarea si functionarea
Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Padurilor, cu modificarile si
completarile ulterioare,
vazand Referatul de aprobare nr. 154.721 din 3 aprilie 2002, intocmit de
Agentia Nationala Sanitara Veterinara,
emite urmatorul ordin:
Art. 1
Se aproba Norma sanitara veterinara privind stabilirea protocoalelor de
testare si conditiile de autorizare a targurilor de animale, fermelor de
carantina sau centrelor de colectare in cazul importurilor de animale vii din
speciile bovine si porcine provenite din tari terte, prevazute in anexa care
face parte integranta din prezentul ordin.
Art. 2
Directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti vor
aduce la indeplinire prevederile prezentului ordin.
Art. 3
Agentia Nationala Sanitara Veterinara va controla modul de aducere la
indeplinire a prezentului ordin.
Art. 4
Prevederile normei sanitare veterinare prevazute la art. 1 vor fi
respectate de Romania in cazul exporturilor de animale vii din speciile bovine
si porcine in Uniunea Europeana, pana cand va deveni stat membru al Uniunii
Europene.
Art. 5
Prezentul ordin va fi publicat in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I,
si va intra in vigoare in termen de 15 zile de la data publicarii lui.
p. Ministrul agriculturii,
alimentatiei si padurilor,
Petre Daea,
secretar de stat
ANEXA 1
NORMA SANITARA VETERINARA
privind stabilirea protocoalelor de testare si conditiile de autorizare a
targurilor de animale, fermelor de carantina sau centrelor de colectare in
cazul importurilor de animale vii din speciile bovine si porcine provenite din
tari terte
CAP. 1
Dispozitii generale
Prezenta norma sanitara veterinara stabileste protocoalele de testare
pentru tuberculoza, bruceloza, leucoza enzootica bovina, bluetongue (febra
catarala), boala epizootica hemoragica, leptospiroza, rinotraheita bovina
infectioasa/vulvovaginita pustulara infectioasa, diareea virala bovina, febra
aftoasa, boala lui Aujeszky, gastroenterita transmisibila, influenta suina,
boala veziculoasa a porcului, pesta porcina clasica, precum si conditiile
pentru autorizarea targurilor de animale, fermelor de carantina sau centrelor
de colectare pentru comertul cu animale din speciile bovine sau porcine
destinate exportului.
CAP. 2
Bovine
A. Tuberculoza
1. Urmatoarele teste vor fi recunoscute ca fiind teste oficiale de
tuberculinare intradermica:
a) testul unic intradermic presupune o singura injectare a tuberculinei
bovine;
b) testul comparativ intradermic solicita o injectare de tuberculina bovina
si o injectare de tuberculina aviara, administrate simultan.
2. Doza de tuberculina injectata va fi:
a) nu mai mica de 2.000 UTC de tuberculina bovina;
b) nu mai mica de 2.000 u.i. de tuberculina aviara W15.
Volumul fiecarei doze injectate nu va depasi 0,2 ml.
3. Testele de tuberculinare se vor efectua prin injectarea tuberculinei/tuberculinelor
in pielea gatului. Locurile de injectare vor fi situate la limita dintre
treimea anterioara si cea mijlocie a gatului. Cand se injecteaza aceluiasi
animal atat tuberculina bovina, cat si tuberculina aviara locul pentru
injectarea tuberculinei aviare va fi la aproximativ 10 cm de linia superioara a
gatului si locul pentru injectarea tuberculinei bovine va fi cu aproximativ
12,5 cm mai jos, pe o linie paralela cu linia umarului sau pe parti diferite
ale gatului; la animalele tinere la care nu exista loc suficient pe o singura
parte a gatului pentru a separa aceste locuri fiecare injectie va fi facuta pe
cate o parte laterala a gatului, in locuri identice situate in centrul treimii
mijlocii a gatului.
4. Tehnica tuberculinarii si interpretarea reactiilor vor fi urmatoarele:
4.1. Tehnica tuberculinarii: locul injectarii va fi tuns si dezinfectat. Se
va prinde intre degetul mare si aratator un pliu al pielii din interiorul zonei
tunse si dezinfectate, se va masura cu sublerul si se va nota valoarea
obtinuta. Un ac scurt, steril, taiat oblic si atasat la o seringa gradata
continand tuberculina va fi introdus oblic in straturile mai profunde ale
pielii. Apoi se va injecta doza de tuberculina. O injectare corecta va fi
confirmata prin palparea unei mici ridicaturi asemanatoare unui bob de mazare
la fiecare loc de injectare. Grosimea pliului pielii din fiecare zona injectata
va fi masurata din nou dupa 72 de ore de la injectare si va fi notata.
4.2. Interpretarea reactiilor
4.2.1. Interpretarea reactiilor se va baza pe observatiile clinice si pe
cresterea/cresterile inregistrata/inregistrate a/ale locurilor de injectare, la
72 de ore dupa injectarea tuberculinei.
a) Reactia este negativa daca se observa doar o inflamare limitata, cu o
crestere nu mai mare de 2 mm a grosimii pliului de piele, fara semne clinice ca
edem difuz sau extins, transpiratie, necroze, dureri sau inflamatii ale
canalelor limfatice din regiunea respectiva sau ale limfonodulilor.
b) Reactia este neconcludenta daca nu se observa semne clinice precum cele
mentionate la lit. a) si daca cresterea pliului de piele este mai mare de 2 mm,
dar mai mica de 4 mm.
c) Reactia este pozitiva daca se observa semne clinice precum cele
mentionate la lit. a) si b) sau daca cresterea pliului de piele de la locul
injectarii este de 4 mm sau mai mare.
4.2.2. Interpretarea testelor oficiale de tuberculinare intradermica va fi
urmatoarea:
4.2.2.1. Testul unic intradermic:
a) pozitiv: o reactie pozitiva ca cea definita la lit. c);
b) neconcludent: o reactie neconcludenta ca cea definita la lit. b);
c) negativ: o reactie negativa ca cea definita la lit. a).
4.2.2.1.1. Animalele care au reactionat neconcludent la testul unic
intradermic vor fi supuse unui alt test dupa minimum 42 de zile.
4.2.2.1.2. Animalele care nu au reactionat negativ la acest al doilea test
vor fi considerate ca fiind pozitive la test.
4.2.2.1.3. Animalele care au reactionat pozitiv la testul unic intradermic
pot fi supuse unui test comparativ intradermic.
4.2.2.2. Testul comparativ intradermic pentru stabilirea si mentinerea
statusului de efectiv oficial indemn de tuberculoza:
a) pozitiv: o reactie pozitiva la tuberculina bovina cu 4 mm mai mare decat
reactia la tuberculina aviara sau prezenta semnelor clinice;
b) neconcludent: o reactie pozitiva sau neconcludenta la tuberculina
bovina, care este cu 1 - 4 mm mai mare decat reactia la tuberculina aviara, si
absenta semnelor clinice;
c) negativ: o reactie negativa la tuberculina bovina sau o reactie pozitiva
ori neconcludenta la tuberculina bovina, dar care este egala sau mai mica decat
o reactie pozitiva ori neconcludenta la tuberculina aviara, precum si absenta
semnelor clinice in ambele cazuri.
4.2.2.2.1. Animalele care au reactionat neconcludent la testul comparativ
intradermic vor fi supuse unui alt test dupa minimum 42 de zile. Animalele care
nu au reactionat negativ la acest al doilea test vor fi considerate ca fiind
pozitive.
4.2.3. Statutul de efectiv oficial indemn de tuberculoza poate fi suspendat
si animalelor din efectiv nu li se va permite sa ia parte la comertul
intracomunitar pana la rezolvarea statusului urmatoarelor animale:
a) animalele care au fost considerate neconcludente la testul unic
intradermic de tuberculinare;
b) animalele care au fost considerate pozitive la testul unic intradermic
in perioada de asteptare a retestarii cu un test comparativ intradermic;
c) animalele care au fost considerate neconcludente la testul comparativ
intradermic.
4.2.4. Atunci cand legislatia sanitara veterinara solicita ca animalele sa
fie supuse unui test intradermic anterior miscarii lor, testul va fi
interpretat astfel incat nici un animal care prezinta o crestere a grosimii
pliului de piele mai mare de 2 mm sau prezinta semne clinice sa nu fie
comercializat.
B. Bruceloza
1. Testele de seroaglutinare
1.1. Serul aglutinant standard trebuie sa fie conform serului etalon
preparat de Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, Regatul Unit
al Marii Britanii si Irlandei de Nord. Fiola trebuie sa contina 1.000 u.i.
aglutinante, obtinute prin liofilizarea a 1 ml ser bovin.
1.2. Aprovizionarea cu serul standard trebuie sa fie asigurata prin
Bundesgesudheitsand, Berlin.
1.3. Titrul aglutinant al serului trebuie sa fie exprimat in unitati
internationale/ml, de exemplu, serum X = 80 u.i./ml.
1.4. Citirile reactiei lente de seroaglutinare in tuburi trebuie facute la
nivelul unei aglutinari de 50% sau 75%, iar antigenul utilizat trebuie sa fie
titrat in conditii identice fata de un ser standard.
1.5. Valorile aglutinante ale diferitilor antigeni fata de serul standard
trebuie sa se incadreze in urmatoarele limite:
a) daca citirea se face la 50% - intre 1/600 si 1/1.000;
b) daca citirea se face la 75% - intre 1/500 si 1/750.
1.6. Pentru prepararea antigenului destinat seroaglutinarii lente in tuburi
trebuie folosite tulpinile Weybridge nr. 99 si USDA 1119 sau orice alte tulpini
de sensibilitate echivalenta.
1.7. Mediile de cultura folosite pentru intretinerea tulpinilor de
laborator, precum si pentru producerea antigenului trebuie sa nu produca
disociere bacteriana S - R, fiind preferabila folosirea agarului cu cartof.
1.8. Emulsia bacteriana trebuie facuta in solutie salina fiziologica NaCl
0,85 la mie, fenolat 5% . Formolul nu trebuie folosit.
1.9. Institutul oficial responsabil de testarea oficiala a antigenilor este
Institutul de Diagnostic si Sanatate Animala, str. dr. Staicovici nr. 63, Bucuresti.
1.10. Antigenii pot fi livrati in forma concentrata cu conditia ca factorul
de dilutie care trebuie utilizat sa fie indicat pe eticheta flaconului.
1.11. Pentru efectuarea unei reactii de seroaglutinare trebuie preparate
cel putin 3 dilutii pentru fiecare ser. Dilutiile serului suspect trebuie
efectuate de asa maniera incat citirea reactiilor la limita de infectie sa fie
facuta in tubul din mijloc. Daca exista o reactie pozitiva in acest tub, serul
suspect contine minimum 30 u.i. aglutinante/ml.
2. Reactia de fixare a complementului
2.1. Serul standard este acelasi cu cel mentionat la pct. 1.1. Pe langa
continutul sau in unitati internationale aglutinante, 1 ml din acest ser bovin
liofilizat trebuie sa contina 1.000 de unitati sensibilizante care fixeaza
complementul. Aceste unitati sensibilizante sunt denumite unitati
sensibilizante CEE.
2.2. Serul standard trebuie sa fie asigurat prin Bundesgesundheitsand,
Berlin.
2.3. Titrul de anticorpi al serului care fixeaza complementul trebuie sa
fie exprimat in unitati sensibilizante CEE (de exemplu: serul X = 60 de unitati
sensibilizante CEE/ml).
2.4. Un ser continand 20 sau mai multe unitati sensibilizante CEE/ml (si
anume o activitate egala cu 20% din cea a serului standard) trebuie sa fie
considerat pozitiv.
2.5. Serurile trebuie inactivate dupa cum urmeaza:
a) serul bovin: la temperatura de 56 - 60 grade C timp de 30 - 50 minute;
b) serul porcin: la temperatura de 60 grade C timp de 30 - 50 minute.
2.6. Tulpina Weybridge nr. 99 sau tulpina USDA 1119 trebuie sa fie folosite
la prepararea antigenului. Antigenul reprezinta o suspensie bacteriana in ser
fiziologic 0,85% NaCl sau in solutie tampon Veronal.
2.7. Pentru efectuarea reactiei de fixare a complementului s-a convenit
utilizarea unei doze de complement superioare dozei minime necesare unei
hemolize totale.
2.8. La efectuarea reactiei de fixare a complementului este necesar sa se
efectueze de fiecare data urmatoarele controale:
a) controlul efectului anticomplementar al serului;
b) controlul antigenului;
c) controlul eritrocitelor sensibilizate;
d) controlul complementului;
e) controlul sensibilitatii la declansarea reactiei, utilizandu-se un ser
pozitiv;
f) controlul specificitatii reactiei, utilizandu-se un ser negativ.
2.9. Supravegherea si controlul oficial al serurilor standard si al
antigenilor trebuie efectuate de organismul mentionat la pct. 1.9.
2.10. Antigenii pot fi livrati in stare concentrata, dar cu mentionarea factorului
de dilutie pe eticheta flaconului.
C. Leucoza enzootica bovina
1. Testul de imunodifuzie in gel de agar pentru leucoza enzootica bovina
(LEB)
1.1. Antigenul care va fi folosit in test trebuie sa contina glicoproteine
ale virusului LEB. Antigenul trebuie sa fie standardizat impotriva unui ser
standard (serul El) furnizat de State Veterinary Serum Laboratory, Copenhaga.
1.2. Institutul oficial care trebuie sa fie raspunzator de calibrarea
antigenului standard de lucru din laborator impotriva serului standard oficial
CEE (serul El) furnizat de State Veterinary Serum Laboratory, Copenhaga, este
Institutul de Diagnostic si Sanatate Animala, str. dr. Staicovici nr. 63,
Bucuresti.
1.3. Antigenii standard folositi in laborator trebuie supusi cel putin o
data pe an, in laboratoarele CEE mentionate la pct. 1.2, testarii contra
serului standard oficial al CE. Separat de aceasta standardizare antigenul din
uz poate fi calibrat conform metodei de standardizare descrise mai jos.
1.4. Reagentii folositi sunt:
a) antigenul: trebuie sa contina glicoproteine specifice ale virusului LEB,
care au fost standardizate contra serului oficial al CEE;
b) serul de testat;
c) serul de control care este cunoscut ca pozitiv;
d) gel de agar: 0,8% agar, 8,5% NaCl, tampon Tris 0,05 M cu pH 7,2. O
cantitate de 15 ml din acest gel trebuie introdusa intr-o placa Petri cu
diametrul de 85 mm, rezultand o grosime de 2,6 mm a agarului.
1.5. Modelul dupa care se realizeaza testul consta in taierea in agar a 7
godeuri uscate, pana la fundul placii; modelul va consta intr-un godeu central
si 6 godeuri plasate circular in jurul acestuia dupa cum urmeaza:
a) diametrul godeului central = 4 mm;
b) diametrul godeurilor periferice = 6 mm;
c) distanta dintre godeul central si godeurile periferice = 3 mm.
1.6. Godeul central trebuie umplut cu antigen standard. Godeurile
periferice 1 si 4 sunt umplute cu ser pozitiv cunoscut, iar godeurile 2, 3, 5
si 6, cu serurile de testat. Godeurile trebuie umplute pana la disparitia
meniscului.
1.7. Aceste rezultate au fost obtinute folosindu-se urmatoarele cantitati:
a) antigen - 32 micro l;
b) ser pozitiv - 73 micro l ser de control;
c) ser de testat - 73 micro l ser care este suspect.
1.8. Incubatia trebuie sa dureze 72 de ore la o temperatura a camerei de 20
- 27 grade C, intr-o incapere inchisa si umeda.
1.9. Testul poate fi citit la 24 si 48 de ore, dar rezultatul final nu
poate fi obtinut inainte de 72 de ore.
a) Serul testat este pozitiv daca formeaza o linie specifica de precipitare
cu antigenul virusului LEB si o linie completa de identificare cu serul de
control.
b) Serul testat este negativ daca nu formeaza o linie specifica de
precipitare cu antigenul virusului LEB si daca nu curbeaza linia produsa de
serul de control.
c) Reactia nu poate fi considerata concludenta daca:
(i) curbeaza linia serului de control spre godeul cu antigenul virusului
LEB, fara a forma o linie de precipitare vizibila cu antigenul; sau
(ii) nu poate fi citita ca negativa sau pozitiva.
In reactiile neconcludente testul poate fi repetat folosindu-se un ser
concentrat.
1.10. Orice alta configuratie sau model poate fi folosit cu conditia ca
serul E4 diluat 1/10 in serul negativ sa poata fi detectat ca fiind pozitiv.
1.1.1. Metoda pentru standardizarea antigenului (Solutii si materiale
necesare)
1. 40 ml de agar 1,6% in tampon Tris/HCl 0,05% M cu pH 7,2 cu 8,5% NaCl;
2. 15 ml ser contra LEB, continand anticorpi doar pentru glicoproteinele
virusului LEB, diluat 1/10 in tampon Tris/HCl 0,05 M, pH 7,2 cu 8,5% NaCl;
3. 15 ml ser contra LEB avand anticorpi doar pentru glicoproteinele
virusului LEB, diluat 1/5 in tampon Tris/HCl 0,05 M, pH 7,2 cu 8,5% NaCl;
4. 4 placi Petri din plastic cu diametrul de 85 mm;
5. un perforator cu un diametru de la 4 mm pana la 6 mm;
6. antigen de referinta;
7. antigenul care urmeaza sa fie standardizat;
8. o baie de apa la temperatura de 56 grade C.
1.1.2. Mod de lucru
a) Se dizolva agarul (1,6%) in tampon Tris/HCl, incalzindu-l cu atentie
pana la temperatura de 100 grade C. Se tine pe baia de apa timp de aproximativ
o ora. De asemenea, se pun dilutiile de ser contra LEB pe o baie de apa.
b) Se amesteca 15 ml din solutia de agar la temperatura de 56 grade C cu 15
ml ser contra LEB (1/10), scuturand rapid si turnand 15 ml in fiecare dintre
cele doua placi Petri. Se repeta aceasta procedura cu serul contra LEB diluat
1/5.
c) Cand agarul s-a intarit se vor practica godeurile si se va face
adaugarea antigenilor dupa cum urmeaza:
1. placile Petri 1 si 3:
a) godeul A - antigen de referinta nediluat;
b) godeul B - antigen de referinta diluat 1/2;
c) godeurile C si E - antigen de referinta;
d) godeul D - antigen de testat nediluat;
2. placile Petri 2 si 4:
a) godeul A - antigenul de testat nediluat;
b) godeul B - antigenul de testat diluat 1/2;
c) godeul C - antigenul de testat diluat 1/4;
d) godeul D - antigenul de testat diluat 1/8.
1.1.3. Instructiuni suplimentare
a) Experimentul trebuie sa fie efectuat cu doua dilutii de ser 1/5 si 1/10
in scopul obtinerii precipitarii optime.
b) Daca diametrul precipitarii este prea mic pentru fiecare dintre cele
doua dilutii, este necesara diluarea in continuare a serului.
c) Daca diametrul precipitarii este prea mare si neclar pentru fiecare
dintre cele doua grade de dilutie, atunci va trebui aleasa o dilutie mai mica a
serului.
d) Concentratia finala a agarului trebuie sa fie de 0,8%, iar cea a
serurilor de 5% si, respectiv, 10% .
e) Se noteaza diametrele masurate in urmatorul sistem de coordonate.
Dilutia de lucru este cea la care s-a inregistrat acelasi diametru pentru
antigenul de testat si antigenul de referinta.
D. Bluetongue (febra catarala)
1. Testul ELISA de blocare sau competitiv se va efectua conform urmatorului
protocol:
a) Testul ELISA competitiv care utilizeaza anticorpul monoclonal 3-17-A3
este capabil sa detecteze anticorpii tuturor serotipurilor cunoscute ale
virusului bluetongue (BTV).
b) Principiul testului consta in intreruperea reactiei dintre antigenul BTV
si un anticorp monoclonal specific de grup (3-17-A3) prin adaugarea dilutiilor
de ser de testare. Anticorpii de BTV prezenti in serul de testare blocheaza
reactivitatea anticorpului monoclonal (ACM) si determina reducerea dezvoltarii
culorii scontate la adaugarea substratului enzimatic.
1.1. Materiale si reactivi:
1. placi de microtitru cu suprafata plata;
2. antigen pregatit conform procedurii descrise mai sus;
3. tampon de blocare: 5% (w/v) lapte praf deshidratat Marvel, 0,1% (v/v) de
tween-20 furnizat sub forma de sirop de polioxietilena sorbiton monolaurat in
PBS;
4. anticorp monoclonal: 3-17-A3 (furnizat sub forma de supernatant de
cultura tisulara hybridoma), depozitat la temperatura de -20 grade C sau
liofilizat, diluat 1/50 cu tampon de blocare inainte de folosire, dirijat
contra polipeptidei p7 specifica grupului;
5. conjugat: globulina de iepure antisoarece (adsorbit si diluat),
conjugata cu peroxidaza din hrean si pastrata la loc intunecos la temperatura
de 4 grade C;
6. substrat si cromogen: 0,2 g de ortofenil diamina (OPD) dizolvat intr-un
tampon de 2,553 g acid citric si 4,574 g disodiu hidrogenortofosfat dizolvat in
500 ml de apa distilata, divizata in alicote de 25 ml si pastrate la loc
intunecos la temperatura de -20 grade C, cu 12 micro l/25 ml de peroxid de
hidrogen (30% w/v) adaugat imediat inainte de utilizare;
ATENTIE! A se utiliza OPD cu atentie, a se purta manusi din cauciuc, produs
suspect de a fi mutagen.
7. acid sulfuric de 1 mol: 26,6 ml de acid sulfuric adaugat la 473,4 ml de
apa distilata;
ATENTIE! Intotdeauna adaugati acidul peste apa, niciodata apa peste acid.
8. agitator orbital;
9. cititor de placa ELISA (testul poate fi citit vizual).
H G F E D C B A
___________________ _______________________________________________
| | | | | | | | | |
|
| Antigen orb + | | | |Antigen + conjugat | |
|
| Control conjugat |
|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|
| | | | | | | | | |
|
| | | | Antigen + acm + Conjugat | |
|
| |
|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|
| | | | | | | | | |
|
| Antigen + Mab | | Antigen + Ser pozitiv + acm + Conjugat
|
| Control conjugat | | | | | | | | |
|
| | | | | | | | | |
|
|___________________| | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16| 1/32|
1/64|1/128|1/256|
|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|
___________________________ | | | | | | | |
|
| | | | | | | | | |
|
| Antigen + ser pozitiv + | | | | Ser de testat | | |
|
| acm + conjugat | | | | | | | | | |
|___________________________|
|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|
| 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16| 1/2 | 1/4 | 1/8 |
1/16|
|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|
|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|
|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|
|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|
|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|
____________________
|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|
| |
|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|
| Seruri de testat | |_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|
|____________________| | | | | | | | |
|
|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|_____|
1.2. Protocolul testului:
Control orb: linia 1A - H este un control orb care contine antigen BTV si
conjugat. Acesta poate fi folosit la etalonarea cititorului ELISA.
1.3. Control ACM: linia 2A - H este controlul anticorpului monoclonal si
cuprinde antigen BTV, anticorp monoclonal si conjugat. Acesta reprezinta un
control negativ. Media valorilor densitatii optice ale acestei linii de control
reprezinta valoarea de inhibitie 0% .
1.4. Control pozitiv: linia 3A - H este controlul pozitiv. Acesta cuprinde
antigen BTV, dilutii de antiser pozitiv BTV, ACM si conjugat si este inclus
pentru a indica faptul ca testul este efectuat corespunzator si ca trebuie sa
se obtina niveluri similare de inhibitie de la un test la altul.
1.5. Serurile de testare: in schema testului prezentata mai sus 18 seruri
pot fi testate in dilutii de 1/2, 1/4, 1/8 si 1/16. Acest lucru ofera
informatii asupra titrului de anticorpi din serurile de testare. Gama de
dilutii poate fi largita pentru a obtine titruri finale de dilutii ale serului.
Alternativ, pentru supraveghere serologica la scara larga, serurile pot fi
testate intr-o singura dilutie (1/4) sau in doua dilutii 1/2 si 1/4 ca test de
control rapid.
1.6. Procedura:
1. Se dilueaza antigen BTV la concentratie pretitrata in PBS, se agita usor
pentru a dispersa virusul agregat (daca agitatorul nu este disponibil, se
pipeteaza puternic) si se adauga 50 micro l in toate godeurile placii ELISA. Se
agita usor marginile placii pentru a se dispersa antigenul.
2. Se incubeaza la temperatura de 37 grade C timp de 60 de minute cu
ajutorul unui agitator orbital. Se spala placile de 3 ori prin golirea si
umplerea godeurilor cu PBS nesteril si se usuca cu ajutorul unei hartii
absorbante.
3. Se adauga 50 micro l la fiecare godeu de tampon de blocare. Se adauga
serurile de testare si ser pozitiv in godeurile corespunzatoare si se dilueaza
pe suprafata placii cu ajutorul unei pipete cu multiple canale. Nu se adauga
ser la controlul orb sau controlul acm.
4. Imediat dupa adaugarea serurilor de testare se adauga acm in tamponul de
blocare la dilutie pretitrata si se adauga 50 micro l in toate godeurile
placii, cu exceptia controlului orb.
5. Se incubeaza la temperatura de 37 grade C timp de 60 de minute intr-un
agitator orbital. Se spala de 3 ori si cu PBS si se usuca cu ajutorul unei
hartii absorbante.
6. Se dilueaza concentratul de iepure antisoarece la 1/5.000 intr-un tampon
de blocare si se adauga 50 micro l in toate godeurile placii.
7. Se incubeaza la temperatura de 37 grade C timp de 60 de minute intr-un
agitator orbital. Se spala de 3 ori si cu PBS si se usuca cu ajutorul unei
hartii absorbante.
8. Se dizolva OPD si imediat inainte de utilizare se adauga 12 micro l de
30% apa oxigenata la fiecare 25 ml de OPD. Se adauga 50 micro l in toate godeurile
placii. Se lasa circa 10 minute sa se dezvolte culoarea si se impiedica reactia
de 1 ml acid sulfuric 50 micro l la godeu. Culoarea trebuie sa se dezvolte in
godeurile de control ACM si in acele godeuri care contin saruri fara anticorpi
la BTV.
9. Se examineaza si se inregistreaza placile fie vizual, fie cu ajutorul
unui cititor spectrofotometric.
1.7. Interpretarea rezultatelor:
a) Se calculeaza valoarea medie a OD dupa citirea controalelor acm. Aceasta
reprezinta valoarea de inhibitie 0% . Citirile densitatii optice a serurilor de
testare sunt exprimate ca valori inhibitoare procentuale, folosindu-se
urmatoarea formula:
OD in prezenta serului de testare
Valoarea de inhibitie procentuala = 100 x -----------------------------------
OD in absenta serului de testare
b) Valorile de inhibitie mai mari de 40% la o dilutie de ser de 1/4 sunt
considerate pozitive. Citirea vizuala este posibila avand in vedere ca
inhibitia de 40% este cea mai mica valoare vizibila.
1.8. Prepararea antigenului BTV ELISA:
1. Se spala de trei ori 10 roux de celule confluente bhk-21 cu un mediu
Eagle fara ser si se infecteaza cu serotipul 1 de virus BTV intr-un mediu Eagle
fara ser.
2. Se incubeaza la temperatura de 37 grade C si se examineaza zilnic pentru
efectul citopatic (CPE).
3. Cand efectul citopatic este evident in 80 - 90% din placa de celule din
fiecare roux se recolteaza virusul prin agitare pentru a detasa celulele ramase
pe sticla.
4. Se centrifugheaza la 2.000 - 3.000 rpm pentru a granula celulele.
5. Se indeparteaza supernatantul si se resuspenda celulele in circa 30 ml
de PBS continand 1% sarkosyl si 2 ml de fluorida fenolmetilsulfonil (tampon de
distrugere a celulelor). Acest lucru poate cauza o gelificare a celulelor si se
pot adauga mai multe tampoane de distrugere a celulelor pentru a reduce acest
efect.
ATENTIE! Fluorura fenolmetilsulfonil este toxica, a se utiliza cu extrema
atentie!
6. Se disociaza celulele timp de 60 de secunde cu ajutorul unei sonde
ultrasonice la o amplitudine de 30 de microni.
7. Se centrifugheaza la 10.000 rpm timp de 10 minute.
8. Se stocheaza supernatantul la temperatura de +4 grade C si se resuspenda
celulele granulate ramase in 10 - 20 ml de tampon de distrugere a celulelor.
9. Se agita cu ajutorul unui aparat cu ultrasunete si se clarifica, se
stocheaza supernatantul in fiecare stadiu, in total de 3 ori.
10. Se aduna supernatantii si se centrifugheaza la 24.000 rpm timp de 120
de minute, la temperatura de +4 grade C peste un strat de 5 ml de 40% sucroza
w/v in PBS, folosindu-se 30 ml tuburi de centrifugare Beckmann si un rotor SW
28.
11. Se inlatura supernatantul, se dreneaza tuburile si se resuspenda
celulele granulate in PBS prin ultrasonare. Se stocheaza antigenul in alicote
la temperatura de -70 grade C.
1.9. Titrarea antigenului BTV ELISA:
Antigenul BTV ELISA este titrat prin ELISA indirect. Doua dilutii de
antigen sunt titrate cu ajutorul unei dilutii constante (1/50) de anticorpi
monoclonali 3-17-A3. Protocolul este urmatorul:
1.10. Procedura:
1. Se dilueaza antigen de BTV in PBS peste placa de microtitru intr-o serie
de doua dilutii 50 micro l/godeu cu ajutorul unei pipete cu multiple canale.
2. Se incubeaza timp de o ora la temperatura de 37 grade C intr-un agitator
orbital.
3. Se spala placile de 3 ori cu PBS.
4. Se adauga 50 micro l de anticorp monoclonal 3-17-A3 diluat 1/50 in
fiecare godeu al placii de microtitru.
5. Se incubeaza timp de o ora la temperatura de 37 grade C intr-un agitator
orbital.
6. Se spala placile de 3 ori cu PBS.
7. Se adauga 50 micro l de globulina de iepure antisoarece conjugata cu
peroxidaza din hrean, diluata la o concentratie optima pretitrata, in fiecare
godeu al placii de microtitru.
8. Se incubeaza timp de o ora la temperatura de 37 grade C intr-un agitator
orbital.
9. Se adauga substrat si cromogen ca mai sus. Se impiedica reactia dupa 10
minute prin adaugarea unui mol de acid sulfuric 50 micro l/godeu.
1.11. In incercarea concurenta anticorpul monoclonal trebuie sa fie in
exces, de aceea se alege o solutie de antigen care se gaseste pe curba de
titrare "nu in zona placii", care da circa 0,8 OD dupa 10 minute.
2. Testul de imunodifuzie pe gel de agar se va efectua conform urmatorului
protocol:
2.1. Antigen: antigenul precipitat este preparat in orice sistem de cultura
celulara care suporta rapida multiplicare a serotipului specific de virus BTV.
Sunt recomandate celulele BHK si Vero. Antigenul este prezent in fluidul
supernatant la finalul cresterii virusului, dar trebuie concentrat de 50 - 100
de ori pentru a fi eficace. Acest lucru se poate realiza prin orice procedura
standard de concentrare proteica; virusul din antigen poate fi inactivat prin
adaugarea a 0,3% v/v betapropiolactona.
2.2. Serul de control pozitiv cunoscut: utilizandu-se un ser de referinta
international si un antigen, este produs un ser national standard, standardizat
la proportii optime in raport cu serul international de referinta, liofilizat
si folosit ca ser de control cunoscut in fiecare test.
2.3. Ser de testare
2.4. Procedura:
a) 1% agaroza preparata in tampon de borat sau barbitol de sodiu, pH 8,5 - 9,0,
este turnata intr-o placa Petri la o adancime minima de 3,0 mm.
b) Un ansamblu de testare format din 7 godeuri lipsite de umezeala, fiecare
cu diametrul de 5,0 mm, este taiat in agar. Ansamblul consta intr-un godeu
central si 6 godeuri dispuse intr-un cerc cu raza de 3 mm.
1
6 2
X
5 3
4
c) Se umple godeul central cu antigen standard. Godeurile periferice 2, 4
si 6 sunt umplute cu serul pozitiv cunoscut, iar godeurile 1, 3 si 5 sunt
umplute cu ser de testat.
d) Sistemul este incubat timp de 72 de ore la temperatura ambianta intr-o
camera inchisa, umeda.
2.5. Interpretare: un ser de testare este pozitiv daca formeaza o linie de
precipitina specifica cu antigenul, precum si o linie completa de identificare
cu serul de control. Un ser de testare este negativ daca nu formeaza o linie
specifica cu antigenul si nu curbeaza linia serului de control. Placile Petri
trebuie examinate pe un fond intunecat si folosind o lumina indirecta.
E. Boala epizootica hemoragica
1. Testul de imunodifuzie pe gel de agar se va efectua conform urmatorului
protocol:
1.1. Antigen: antigenul precipitat este preparat in orice sistem de cultura
celulara compatibil cu rapida multiplicare a serotipului specific virusului
bolii epizootice hemoragice. Sunt recomandate celulele BHK si Vero. Antigenul
este prezent in fluidul supernatant la finalul cresterii virusului, dar trebuie
concentrat de 50 - 100 de ori pentru a fi eficient. Acest lucru se poate
realiza prin orice procedura standard de concentrare proteica; virusul din
antigen poate fi inactivat prin adaugarea a 0,3% v/v betapropiolactona.
1.2. Serul de control pozitiv cunoscut: utilizandu-se serul international
de referinta si un antigen, este produs un ser national standard, standardizat
pentru a obtine o proportie optima in raport cu serul de referinta
international, liofilizat si folosit ca ser de control cunoscut in fiecare
test.
Serul de testat
1.3. Procedura: 1% agaroza preparata in tampon de borat sau barbitol de
sodiu, pH 8,5 - 9,0, este turnata intr-o placa Petri la o adancime minima de
3,0 mm.
1.4. Un ansamblu de testare format din 7 godeuri lipsite de umezeala,
fiecare cu diametrul de 5,0 mm, este taiat in agar. Ansamblul consta intr-un
godeu central si 6 godeuri dispuse intr-un cerc cu raza de 3 mm, de exemplu:
1
6 2
X
5 3
4
1.5. Godeul central este umplut cu antigen standard. Godeurile periferice
2, 4 si 6 sunt umplute cu serul pozitiv cunoscut, iar godeurile 1, 3 si 5 sunt
umplute cu ser de testare.
1.6. Sistemul este incubat timp de 72 de ore la temperatura ambianta intr-o
incapere inchisa, umeda.
1.7. Interpretare: un ser de testare este pozitiv daca formeaza o linie de
precipitina specifica cu antigenul, precum si o linie completa de identificare
cu serul de control. Un ser de testare este negativ daca nu formeaza o linie
specifica cu antigenul si nu curbeaza linia serului de control. Placile Petri
trebuie examinate pe un fond intunecat si folosind o lumina indirecta.
F. Leptospiroza
1. Testul de aglutinare microscopica va fi efectuat conform urmatorului
protocol:
1.1. Culturi: trebuie pastrate in mediile Korthof's sau EMJH la temperatura
de 30 grade C.
1.2. Antigen: contine 2 x 10^8 organisme/ml din mediul de cultura.
1.3. Procedura: cantitati egale de antigen si ser sunt amestecate in placi
de microtitru cu fund plat si sunt incubate la temperatura de 30 grade C timp
de doua ore sau la temperatura de 37 grade C timp de 1 - 1 1/2 h. Testul este
citit intr-o lumina slaba, pe fond intunecat, folosind o magnitudine intre 60x
si 100x.
1.4. Interpretare: rezultatul este negativ daca aglutinarea este mai mica
de 50% la o dilutie de 1/50.
G. Rinotraheita bovina infectioasa/vulvovaginita pustulara infectioasa
1. Testul de neutralizare a serului se va efectua conform urmatorului
protocol:
1.1. Ser: toate serurile sunt inactivate la temperatura de 56 grade C timp
de 30 de minute inainte de folosire.
1.2. Procedura: pentru testul de seroneutralizare constanta a diferitelor
tipuri de virusuri, realizat pe placi de microtitru, se folosesc celulele MDBK
sau alte celule corespunzatoare. Tulpinile Colorado, Oxford sau orice alta
tulpina de virus de referinta sunt folosite la 100 TCID50 la 0,025 ml; probe de
ser nediluat inactivat sunt amestecate cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie
de virus. Amestecurile de ser/virus sunt incubate timp de 2 ore la temperatura
de 37 grade C in placile de microtitru, inainte ca celulele MDBK sa fie
adaugate. Celulele sunt folosite la o concentratie care formeaza o monocultura
completa dupa 24 de ore.
1.3. Controale:
a) infectiozitatea virusului;
b) toxicitatea serului;
c) culturi celulare care nu au fost inoculate;
d) antiseruri de referinta.
1.4. Interpretare: rezultatele testului de neutralizare si titrul virusului
folosit la testare sunt inregistrate dupa 3 - 6 zile de incubare la temperatura
de 37 grade C. Titrurile serului sunt considerate negative daca nu exista nici
o neutralizare la o dilutie de 1/2 (ser nediluat).
H. Diaree virala bovina (BVD)
1. Testul de izolare a virusului va fi efectuat conform urmatorului
protocol:
a) Materialul de testare si metodele de detectare: se folosesc suspensii de
ser, portiuni retractile de coagul sau coaguli de sange colectate de la probe
de sange proaspat, care nu au fost inactivate la cald, prelevate de la animale
domestice de mai mult de 6 luni. Se foloseste o procedura de colorare
imunologica, precum tehnica anticorpului fluorescent (FA) sau ELISA, de exemplu
imunoperoxidaza (IPX), pentru a detecta virusul BVD in culturile inoculate.
b) Reactivii de testare: pentru testul FA se cere antiser specific de BVD conjugat
cu FITC. Pentru testul IPX se cere ser anti-BVD specific, neconjugat, de
origine bovina, antiser antibovin conjugat cu peroxidaza si substrat enzimatic
corespunzator (de exemplu: 3-amino-9-etilcarbazol). Se poate folosi ser
anti-BVD recoltat de la alte specii decat bovine, cu conditia ca conjugatul de
peroxidaza sa fie dirijat impotriva globulinelor serice ale speciei respective.
Toate serurile antivirale folosite trebuie sa aiba o specificitate dovedita si
sa prezinte o reactivitate mare.
c) Procedura: testul foloseste celule susceptibile ca celule turbinate
bovine, rinichi de vitel sau testicul de vitel fara virus BVD endogen. Probe de
ser: serul de testare si celulele de cultura tisulara sunt plasate in culturi
in tuburi acoperite cu dop, in godeuri de placi de microtitru sau alte
containere, astfel incat dilutia finala sa fie 10% .
d) Invelisul inflamator si cheagurile de sange: probele sunt adaugate la
culturi celulare monostratificate, confluente si lasate timp de o ora la
temperatura de 37 grade C, apoi culturile sunt spalate si acoperite de mediu de
cultura ce contine 10% ser de fetus de vitel, indemn de BVD. Culturile sunt
incubate ulterior la temperatura de 37 grade C, fixate si colorate prin
metodele FA sau IPX.
e) Controale:
1. control pozitiv al virusului BVD;
2. control negativ fara adaos de virus.
f) Interpretare: testul FA este colorat dupa 4 - 6 zile de incubare si
citit cu ajutorul razelor ultraviolete. Fluorescenta celulelor incubate cu
probele de testat este interpretata ca rezultat pozitiv. Testul IPX este
colorat dupa 4 zile de incubare si citit la lumina microscopica. Culoarea maro
inchis aparuta in citoplasma anumitor celule este interpretata ca rezultat
pozitiv.
2. Testul de seroneutralizare serologica va fi efectuat conform urmatorului
protocol:
a) Ser: toate serurile sunt inactivate la cald, la temperatura de 56 grade
C, timp de 30 de minute inainte de utilizare.
b) Procedura: testul de neutralizare constanta a diferitelor tipuri de
virus pe placi de microtitru foloseste celule bovine corespunzatoare,
multiplicate in serii (celule bovine turbinate, descrise de Mcclurkin si altii,
1974, Arch. ges. Virusforch., p. 45, 285 - 289).
c) Este esential ca toti reactivii si celulele sa fie indemne de virusul
BVD/MD necitopatic, accidental contaminante.
d) Virusul de testare, care poate fi orice tulpina corespunzatoare de
referinta citopatica (de exemplu: tulpina NADL), este folosit la o concentratie
de 100 doze infectioase de cultura celulara medie la 0,025 ml. Dilutii de
seruri inactivate sunt amestecate cu volume egale de suspensie virala (0,025
ml) si amestecurile de ser - virus sunt incubate timp de o ora la temperatura
de 37 grade inainte de a fi adaugate volume similare de suspensie celulara.
Celulele sunt folosite la o concentratie care va forma un monostrat complet
dupa doua zile.
e) Controale:
1. controlul infectiozitatii virusului;
2. controlul toxicitatii serului;
3. controlul culturii celulare neinoculate;
4. antiseruri de referinta.
f) Interpretare: cu virusul tulpinii NADL timpul optim pentru citire este
dupa o incubare de 5 zile la temperatura de 37 grade C.
g) Un titru de neutralizare mediu de 1/10 este considerat indicator al unei
reactii imunitare la o infectie anterioara acuta.
I. Depistarea mamitelor
Analiza laptelui va fi realizata conform legislatiei in vigoare.
J. Febra aftoasa
1. Colectarea probelor de esofag/faringe si testarea lor se vor efectua
conform urmatorului protocol:
a) Reactivi: inainte de prelevare este preparat mediul de transport. Se
distribuie un volum de 2 ml intr-un numar de containere egal cu numarul de
animale care vor fi testate. Containerele trebuie sa reziste la congelare cu
CO2 solid sau azot lichid. Probele se obtin cu ajutorul unui aparat de recoltat
saliva sau prin tehnica "probang". Pentru a obtine o proba se
plaseaza sonda in gura sub limba si in partea superioara a esofagului. Se
incearca frecarea/raclarea suprafetei epiteliului din partea superioara a
esofagului si faringelui prin miscari laterale si dorsale. Dispozitivul probang
este retras, de preferinta, dupa ce animalul a inghitit. Sonda trebuie sa fie
plina si sa contina un amestec de mucus, saliva, fluid esofagian si fragmente
celulare. Se vor lua masuri ca fiecare specimen sa contina material celular
vizibil. Se vor evita miscarile bruste, care pot provoca sangerari.
Probele prelevate de la anumite animale pot fi puternic contaminate cu
continut ruminal. In acest caz probele sunt indepartate si se spala gura
animalului cu apa sau cu lichid fiziologic inainte de repetarea operatiei.
b) Tratarea probelor: se examineaza calitatea fiecarei probe colectate in
dispozitivul probang si se adauga 2 ml intr-un volum egal cu mediul de
transport intr-un container rezistent la congelare. Containerele sunt inchise
ermetic, sigilate, dezinfectate si etichetate. Probele sunt tinute la rece la
temperatura de +4 grade C si examinate dupa 3 - 4 ore sau plasate in gheata
uscata la temperatura de -69 grade C sau in azot lichid si pastrate in stare
congelata pana la examinare. Intre doua prelevari se spala si se clateste
dispozitivul probang de 3 ori cu apa curata.
c) Testarea virusului FMD: probele sunt inoculate in culturi de celule
primare bovine tiroidiene, folosindu-se cel putin 3 tuburi la o prelevare. Pot
fi folosite alte celule asemanatoare, precum celule primare de rinichi de
bovine sau porcine, dar trebuie retinut ca aceste celule sunt mai putin
sensibile la anumite tulpini de FMDV. Tuburile sunt inoculate la temperatura de
37 grade C intr-un aparat de rulare si sunt examinate zilnic timp de 48 de ore
pentru detectarea prezentei efectului citopatic (CPE). Daca sunt negative,
culturile sunt plasate in alte culturi si reexaminate timp de 48 de ore. Se va
confirma specificitatea tuturor CPE.
d) Mijloace de transport recomandate:
1. tampon fosfat de 0,08 M, pH 7,2, continand 0,01% albumina de ser bovin,
0,002% rosu de fenol si antibiotice;
2. mediu de cultura tisulara (Eagle's MEM) continand tampon Hepes de 0,04
M, 0,01% albumina de ser bovin si antibiotice, pH 7,2.
e) La mediul de transport trebuie adaugate antibioticele (la ml final):
1. penicilina 1.000 u.i.;
2. sulfat de neomicina 100 u.i.;
3. sulfat de polimixina B 50 u.i.;
4. micostatin 100 u.i.
2. Testul de seroneutralizare a virusului trebuie efectuat conform
urmatorului protocol:
a) Reactivi: se prepara antigenul FMDV de stoc in culturi celulare sau pe
limba de bovina si se pastreaza la temperatura de 70 grade C, mai mica sau la
temperatura de -20 grade C dupa adaugarea a 50% glicerol. Acesta constituie
antigenul stoc. In aceste conditii FMDV este stabil si titrurile variaza foarte
putin pe o perioada de cateva luni.
b) Procedura: testul este realizat pe placi de microtitru cu fund plat,
prevazute pentru culturi celulare, folosind celule sensibile ca IB-RS-2, BHK-21
sau celule de rinichi de vitel.
Serurile de testat sunt diluate 1/4 intr-un mediu de culturi celulare fara
ser, la care se adauga 100 u.i./ml neomicina sau alte antibiotice adecvate.
Serurile sunt inactivate la temperatura de 56 grade C timp de 30 de minute si
se folosesc volume de 0,05 ml pentru prepararea unor serii duble pe placi de
microtitru utilizand 0,05 ml verigi diluante. Se adauga apoi in fiecare godeu
virus pretitrat, diluat in mediu de cultura fara ser, continand 100 TCID50/0,05
ml. Dupa incubare la temperatura de 37 grade C timp de o ora pentru a permite
reactia de neutralizare se adauga in fiecare godeu 0,05 ml de suspensie celulara
ce contine 0,5 - 1,0 x 106 celule la ml intr-un mediu de cultura celulara
continand ser fara anticorpi la FMD, dupa care placile sunt sigilate. Placile
sunt incubate la temperatura de 37 grade C. Monoculturile devin normal
confluente in 24 de ore. CPE este in mod normal suficient de dezvoltat la 48 de
ore pentru a permite o citire microscopica a testului. In acest moment se poate
efectua o citire microscopica finala sau placile pot fi fixate si colorate in
vederea unei citiri macroscopice, utilizandu-se, de exemplu, 10% formol si
0,05% albastru de metilen.
c) Controale: controalele fiecarui test cuprind antiserul corespunzator al
titrului cunoscut, controlul celulelor, controlul toxicitatii serului,
controlul mediului si titrul virusului de la care se calculeaza cantitatea
reala a virusului continuta in test.
d) Interpretare: godeurile care prezinta CPE sunt considerate infectate si
titrurile de neutralizare sunt exprimate ca reprezentand reciproca dilutiei
finale de ser prezent in amestecurile de ser - virus la punctul final de 50%
estimat dupa metoda Spearman-Karber.
e) Testele sunt considerate valide daca cantitatea reala de virus folosita
la godeu este cuprinsa intre 101,5 si 102,5 TCID50 si daca titrul serului de
referinta se gaseste intr-o zona dubla a titrului anticipat, estimat dupa modul
de realizare a titrarilor precedente. Cand martorii se gasesc in afara acestor
limite se repeta probele. Un titru final de 1/11 sau inferior este considerat
negativ.
3. Detectarea si cuantificarea anticorpului prin testul ELISA se va efectua
conform urmatorului protocol:
a) Reactivi: antiseruri de iepure impotriva antigenului 146S de 7 tipuri de
virus ai febrei aftoase (FMDV) folosite la o concentratie optima predeterminata
intr-un tampon de carbonat/bicarbonat cu pH 9,6. Se prepara antigeni din
tulpinile de virus selectate, cultivate pe celule monocelulare BHK-21. Se
utilizeaza supernatanti nepurificati, pretitrati conform protocolului, dar fara
ser pentru a da o dilutie, care dupa adaugarea unui volum egal de PBST (lichid
fiziologic tamponat cu fosfat, continand 0,05% Tween-20 si indicator rosu
fenol) ar da o intensitate optica intre 1,2 si 1,5. Virusurile pot fi folosite
inactivate. PBST este folosit ca diluant. Se prepara serurile de cobai prin
inocularea cobailor cu antigen 146S din fiecare serotip. Se prepara o
concentratie optima predeterminata in PBST, ce contine 10% ser normal de bovina
si 5% ser normal de iepure. Se foloseste imunoglobulina de iepure anticobai
conjugata cu peroxidaza din hrean la o concentratie optima predeterminata in
PBST, ce contine 10% ser normal de bovina si 5% ser normal de iepure. Serurile
de testat sunt diluate in PBST.
b) Procedura:
1. Placile ELISA sunt acoperite cu 59 u.i. seruri antivirale de iepure si
lasate peste noapte intr-o incinta umeda, la temperatura ambianta.
2. Se prepara 50 micro l de duplicat, serii duble din fiecare ser de testat
incepand cu 1/4 in placi cu multe godeuri si cu fundul in forma de U (placi
purtatoare). Se adauga in fiecare godeu 50 micro l dintr-o doza constanta de
antigen si se lasa amestecurile peste noapte la temperatura de 4 grade C.
Adaugarea antigenului reduce dilutia serica initiala la 1/8.
3. Se spala placile ELISA cu PBST de 5 ori.
4. Se transfera apoi 50 micro l din amestecurile ser - antigen din placile
purtatoare in placile ELISA acoperite cu ser de iepure si se incubeaza la
temperatura de 37 grade C timp de o ora pe un agitator rotativ.
5. Dupa spalare se adauga in fiecare godeu 50 u.i. de antiser de cobai la
antigenul folosit la lit. d). Se incubeaza placile la temperatura de 37 grade C
timp de o ora pe un agitator rotativ.
6. Se spala placile si se adauga in fiecare godeu 50 micro l de
imunoglobulina de iepure anticobai, conjugata cu peroxidaza din hrean. Placile
sunt incubate la temperatura de 37 grade C timp de o ora pe un agitator
rotativ.
7. Se spala placile si se adauga in fiecare godeu 50 u.i. de ortofenilen
diamina, ce contine 0,05% H2O2 30% p/v.
8. Dupa 15 minute se opreste reactia cu H2SO4 de 1,25 M. Se efectueaza
citirea spectrofotometrica a placilor la 492 nm cu ajutorul unui cititor ELISA,
cuplat la un microordinator.
c) Controale: pentru fiecare antigen utilizat 40 de godeuri nu contin ser,
ci antigen diluat intr-un PBST:
1. o serie dubla de doua dilutii de antiser bovin omolog de referinta;
2. o serie dubla de doua dilutii de ser bovin negativ.
d) Interpretare: titrurile anticorpilor sunt exprimate ca reprezentand
dilutia finala a serurilor de testat, dand 50% din valoarea medie OD
inregistrata in godeurile de control al virusului in absenta serului de testat.
Titrurile superioare valorii de 1/40 sunt considerate pozitive.
CAP. 3
Porcine
A. Tuberculoza
Testul tuberculinic intradermic, care utilizeaza tuberculina aviara,
trebuie efectuat in conformitate cu procedurile din cap. II lit. A pct. 1, cu
exceptia faptului ca locul injectiei va fi pielea fina de la baza urechii.
B. Bruceloza
Testul de seroaglutinare si de fixare a complementului va fi efectuat in
conformitate cu cap. II lit. B pct. 1 si 2.
C. Boala lui Aujeszky
Testul de seroneutralizare se va efectua in conformitate cu urmatorul
protocol:
a) Serul: toate serurile sunt inactivate prin incalzire la temperatura de 56
grade C timp de 30 de minute inainte de utilizare.
b) Procedura: testul de seroneutralizare cu virus constant pe diferite
placi de microtitru foloseste sisteme celulare Vero sau alte sisteme celulare
senzitive. Virusul bolii lui Aujeszky este utilizat la 100 TCID50 per 0,025 ml;
probele de seruri inactivate, nediluate, sunt amestecate cu un volum egal
(0,025 ml) de suspensie de virus. Amestecul virus - ser este incubat timp de
doua ore la temperatura de 37 grade C in placi de microtitru inainte de adaugarea
celulelor potrivite. Celulele sunt utilizate intr-o concentratie, care formeaza
dupa 24 de ore un monostrat complet.
c) Controale:
1. verificarea infectiozitatii virusului;
2. controlul toxicitatii serului;
3. controlul culturilor celulare neinoculate;
4. referinta antiserului.
d) Interpretare: rezultatele testului de neutralizare si titrul virusului
utilizat in test se inregistreaza dupa 3 - 7 zile de incubare la temperatura de
37 grade C. Daca titrul serului este mai putin de jumatate (material seminal
nediluat) testul este considerat negativ.
D. Gastroenterita transmisibila (TGE)
Testul de seroneutralizare va fi efectuat in conformitate cu urmatorul
protocol:
a) Serul: toate serurile sunt inactivate prin incalzire la temperatura de
56 grade C timp de 30 de minute inaintea utilizarii.
b) Procedura: testul de seroneutralizare pe placi de microtitru foloseste
celule A72 (tumori de caine) sau alte sisteme celulare sensibile. Virusul TGE
se foloseste la 100 TCID50 per 0,025 ml; probele de ser inactivate, nediluate,
sunt amestecate cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie virala. Amestecul
virus - ser este incubat 30 - 60 minute la temperatura de 37 grade C in placile
de microtitru inainte de a se adauga celulele potrivite. Celulele sunt
utilizate intr-o concentratie, care dupa 24 de ore formeaza un monostrat
complet. Fiecare celula primeste 0,1 ml de suspensie celulara.
c) Controale:
1. verificarea infectiozitatii virusului;
2. controlul toxicitatii serului;
3. controlul celulelor neinoculate;
4. referinte antiser.
d) Interpretare: rezultatele testului de seroneutralizare si titrul
virusului utilizat in test sunt inregistrate dupa o incubare de 3 - 5 zile la
temperatura de 37 grade C. Daca titrul serului este mai putin de jumatate
(dilutie finala), testul este considerat negativ. Daca probele de ser nediluat
sunt toxice pentru tesuturile de cultura, aceste seruri pot fi diluate 1/2
inainte de a fi utilizate in test. Acesta corespunde unei dilutii finale a
serului de 1/4. La titrul serului mai putin de 1/4 (dilutie finala) testul este
considerat negativ.
E. Influenta suina
Testul de inhibare a hemaglutinarii se va efectua conform urmatorului
protocol:
a) Procedura: testul se realizeaza prin metode standard pentru distrugerea
inhibitorilor nespecifici; serurile suine ar trebui tratate fie cu o enzima
care distruge receptorii (filtrat de Vibrio Cholerae), incubata peste noapte la
temperatura de 37 grade C, acest tratament fiind urmat de o reincalzire la
temperatura de 37 grade C timp de 30 de minute pentru distrugerea intregii
activitati reziduale enzimatice, fie cu 25% kaolina, pastrata pe durata noptii
la temperatura de 4 grade C. Dupa absorbtia cu o suspensie de eritrocite de pasare
10% incubata timp de o ora la temperatura de 37 grade C, serurile sunt testate
cu ajutorul a 4 unitati hemaglutinante ale virusului respectiv, utilizandu-se
eritrocite de pasare 1% . Virusul si serul se lasa in contact timp de 60 de
minute la temperatura camerei inainte de adaugarea eritrocitelor.
b) Interpretare: titrurile de 1/10 sau mai mari sunt considerate pozitive.
F. Febra aftoasa
Testele pentru febra aftoasa la porcine se vor efectua conform
protocoalelor stabilite in cap. II lit. J.
G. Boala veziculoasa a porcului
Testul de seroneutralizare se va efectua conform urmatorului protocol:
a) Serul: toate serurile sunt inactivate prin incalzire la temperatura de
56 grade C timp de 30 minute inainte de utilizare.
b) Procedura: testul de seroneutralizare cu virus constant variabil pe
placi de microtitru foloseste celule IB-RS-2 sau alte sisteme celulare
senzitive G27/72 sau orice alt tip de tulpina utilizata la 100 TCID50 per 0,025
ml. Serurile testate sunt diluate 1/4 si inactivate, apoi se prepara doua serii
de dilutii. Probele de ser sunt amestecate cu un volum egal de suspensie virala
si incubate timp de o ora la temperatura de 37 grade C in placile de microtitru
inainte de adaugarea a 0,025 ml suspensie celulara continand 3 x 106 celule/ml.
c) Controale:
1. verificarea infectiozitatii virusului;
2. controlul toxicitatii serului;
3. controlul celulelor neinoculate;
4. referinta antiserurilor.
d) Interpretare: rezultatul testului si titrul virusului utilizat in test
sunt inregistrate dupa 3 - 5 zile de incubare la temperatura de 37 grade C.
Titrul serului este considerat negativ daca nu exista neutralizare la dilutia
1/11.
H. Pesta porcina clasica (PPC)
Recoltarea materialelor pentru diagnostic
1. Pentru izolarea virusului si detectarea antigenilor sunt considerate
importante portiuni de tesut din splina si amigdale. Este de dorit sa se
recolteze inca cel putin alte doua tesuturi limfatice (cum ar fi: limfonodulii
retrofaringieni, paratiroidieni, mandibulari sau mezenterici) alaturi de ileon
sau rinichi. Fiecare proba de tesut va fi pusa intr-o punga de plastic
separata, sigilata si etichetata. Probele vor fi transportate si depozitate in
containere etanse. Probele nu vor fi congelate, dar vor fi tinute la
temperatura de refrigerare si supuse testarii fara intarziere.
2. Probele de sange pentru izolarea virusului din leucocite se vor recolta
de la porci care au febra sau care prezinta alte semne de boala. Ca
anticoagulant se va folosi EDTA sau heparina. Probele se pastreaza la
temperatura de refrigerare si se trimit la laborator fara intarziere pentru
efectuarea testelor.
3. Probele de sange pentru detectarea anticorpilor ca un ajutor pentru
diagnosticul clinic in focar sau pentru supravegherea efectivelor vor fi
recoltate de la animale care s-au insanatosit dupa ce au trecut prin infectii
suspecte sau de la porci cunoscuti ca au avut contact cu animale infectate sau
suspecte. In fiecare exploatatie suspecta tuturor animalelor dintre primele 20
suspecte de boala sau suspecte ca au avut contact cu animale bolnave si la 25%
din restul animalelor li se vor recolta probe de sange. In ideea asigurarii
unei foarte mari probabilitati de detectare a anticorpilor probele vor fi
recoltate din fiecare unitate a exploatatiei.
Diagnosticul de laborator al PPC
1. Bazele diagnosticului de laborator al PPC constau in evidentierea
antigenilor virali, a virusului sau a anticorpilor prezenti in organe ori
fluide tisulare.
2. In cazul unor rezultate neconcludente testele vor fi repetate pe
aceleasi probe. Daca suspiciunile clinice continua, se vor recolta probe
suplimentare din aceleasi surse.
3. Testele serologice pentru evidentierea anticorpilor pot fi folosite ca
un criteriu secundar de diagnostic al cazurilor suspecte de PPC. Daca
evidentierea antigenilor virali sau izolarea virusului nu s-a putut realiza pe
materialele provenite de la animale care au dat nastere suspiciunii de PPC sau
cu materiale din exploatatii care au avut contact cu cazuri de PPC, testele
pentru evidentierea anticorpilor se vor efectua pe probe de sange de la animale
care nu mai sunt suspecte si de la animale suspecte de a fi avut contact cu
boala.
Evidentierea antigenului viral
1. Pentru evidentierea antigenului viral din portiuni de tesut din organe
din tesuturi imunocompetente trebuie sa fie utilizata tehnica prin care se
obtin sectiuni subtiri la criostat de pana la 5 microni, din tonsile sau din
alte organe mentionate la titlul "Recoltarea materialelor pentru
diagnostic". Reagentul de diagnostic trebuie sa fie un antiser policlonal
specific - pestivirus - pentru virusul PPC, marcat cu fluorocrom (marcaj
luminiscent), cu o enzima sau cu biotina, in conformitate cu urmatoarele
criterii:
a) serul hiperimun va fi preparat de la porci care sunt liberi de infectii,
iar serul lor nu contine nici un fel de anticorpi care ar putea afecta
specificitatea sau calitatea reactiilor;
b) imunoglobulinele marcate, preparate din ser hiperimun PPC de porc, dupa
cum se mentioneaza la lit. a), vor avea un titru minim de lucru de 1/20,
determinat pe culturi celulare infectate cu virusul PPC si confirmat prin teste
de verificare pe sectiuni de tesut. Dilutia de lucru a conjugatului trebuie sa
combine maximum de semnal cu minimum de colorare a fondului.
2. Orice proba care indica o reactie citoplasmatica specifica va fi
considerata pozitiva pentru pestivirus. In asemenea cazuri testele ulterioare
trebuie efectuate conform descrierii de la titlul "Teste serologice pentru
diagnosticul diferential dintre PPC si alte pestivirusuri".
Izolarea virusului si identificarea in culturi celulare
1. Izolarea virusului din probe de tesut se face pe culturi celulare
sensibile PK 15 sau pe alte linii celulare la fel de sensibile (susceptibile).
Suspensia din organul provenit de la animalul suspect se va inocula la dilutia
de 1/10.
2. Izolarea virusului din probe de sange, recoltat si manipulat dupa cum
este indicat la titlul "Recoltarea materialelor pentru diagnostic",
se realizeaza prin inocularea culturilor celulare cu o suspensie de globule
albe, reconstituita pana la volumul original de sange.
3. Pentru detectarea antigenului viral in citoplasma inoculatelor aceste
culturi celulare trebuie tratate cu un antiser policlonal marcat. Colorarea
trebuie sa se realizeze la intervale de 24 si 72 de ore din momentul
inocularii.
4. Culturile pozitive trebuie sa faca obiectul testelor de diagnostic
diferential, dupa cum se specifica la titlul "Teste serologice pentru
diagnosticul diferential dintre PPC si alte pestivirusuri". Rezultatele
negative dupa primul pasaj pe culturi celulare determina efectuarea unui al
doilea pasaj sau chiar a mai multor pasaje pentru izolarea virusului.
Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali
1. Duplicatele sectiunilor tisulare criostatice sau ale culturilor celulare
care prezinta reactii pozitive cu serul policlonal antivirus descris la
titlurile "Evidentierea antigenului viral" si "Izolarea
virusurilor si identificarea in culturi celulare" vor fi examinate din nou
cu ajutorul anticorpilor monoclonali marcati, pentru a diferentia virusul PPC
de virusul diareei virale bovine sau al bolii mucoaselor (BVD/MD).
2. Trebuie sa se utilizeze numai anticorpii monoclonali recomandati oficial
de catre laboratorul comunitar de referinta pentru pesta porcina clasica.
3. Anticorpii monoclonali trebuie sa fie grupati in 4 liste, conform
urmatoarelor criterii:
Numarul grupei Reactivitate
_______________________________________________________
1 ...................... Toate virusurile pestoase
2 ...................... Toate virusurile PPC
3 ...................... Suse ale vaccinului contra PPC
4 ...................... Toate virusurile BVD/MD
Fiecare lista poate fi reprezentata fie printr-un singur anticorp
monoclonal, fie de un melanj de anticorpi monoclonali, astfel incat spectrul de
reactivitate sa corespunda celui indicat anterior.
4. Interpretarea profilului reactiei poate fi rezumata astfel:
______________________________________
Tabel Interpretare
______________________________________
1 2 3 4
______________________________________
+ + - - PPC confirmat
+ + + - PPC tulpina vaccinala
+ - - + Virus BVB/MD
______________________________________
Detectarea anticorpilor antivirali ai pestei porcine clasice
1. Detectarea anticorpilor antivirali PPC in esantioanele de sange se
efectueaza pentru a veni in sprijinul diagnosticarii pestei porcine in unitati
cu porci care prezinta semne clinice de boala sau pentru a decela boala la
porcii recunoscuti a fi avut contacte cu porci infectati. Aceasta proba poate
fi efectuata in egala masura la sfarsitul perioadei de supraveghere sau pentru
a controla efectivele al caror statut este necunoscut.
2. Pentru aceasta, probele de sange trebuie sa fie supuse unui test
aprobat. Urmatoarele teste sunt aprobate pentru utilizare si trebuie sa
comporte includerea serurilor de control pozitive si negative. Susele de virus
de utilizat pentru testele serologice trebuie sa fie agreate de laboratorul de
referinta comunitara pentru pesta porcina clasica.
Testul de neutralizare a virusului
1. Acest test se bazeaza pe determinarea titrului neutralizant 50% final.
Se inoculeaza culturile cu un amestec din serul diluat si o cantitate constanta
de virus dupa o perioada specifica de incubare la temperatura de 37 grade C.
Rezultatele se bazeaza pe absenta unei replicari virale detectabile printr-un
sistem de anticorpi marcati. Se poate utiliza fie testul de neutralizare -
imunofluorescenta, fie de neutralizare - imunoperoxidaza.
2. In scopul detectarii se vor dilua initial serurile 1/10. Daca este
necesara o titrare completa, se prepara dilutii ale serului in baza doi
incepand cu dilutia 1/10. Fiecare dilutie se amesteca cu un volum egal de
suspensie de virus care contine 100 "10,5 10 g 10 doze infectante"
"TCID50". Se utilizeaza pentru fiecare dilutie cel putin doua culturi.
Dupa o perioada corespunzatoare de incubare culturile celulare se fixeaza si
antigenul viral se poate detecta printr-un procedeu de colorare cu ajutorul
anticorpilor marcati. Rezultatele se exprima prin reciproca dilutiei initiale a
serului pentru care jumatate din culturile de celule inoculate nu prezinta
coloratie specifica. Se estimeaza titrul la zona dintre doua dilutii.
Metoda imunoenzimatica (ELISA)
1. Se pot utiliza pe orice suport adecvat tehnici competitive, prin blocaj
sau indirecte, pentru ca testele utilizate sa reduca la minimum reactiile
incrucisate cu virusul diareei virale bovine si cu alte pestivirusuri. Totusi
sistemul de testare trebuie sa garanteze identificarea tuturor infectiilor
datorate PPC si a tuturor stadiilor raspunsului imunitar fata de infectie.
2. Antigenul trebuie sa provina din proteine virale ale unuia dintre susele
recomandate de virus al PPC sau care sa ii corespunda. Celulele utilizate la
prepararea antigenului trebuie sa fie indemne fata de orice infectie indusa de
pestivirusuri.
3. Antiserurile policlonale pentru probele prin competitie sau prin blocare
trebuie sa se produca pe porci sau iepuri infectati cu una dintre susele
recomandate ale virusului PPC sau prin susa C lapinizata. Anticorpii monoclonali
trebuie sa fie dirijati contra unei proteine virale imunodominante a virusului
PPC sau sa ii corespunda acesteia.
4. Testele indirecte trebuie sa utilizeze un ser antiimunoglubuline de porc
care sa detecteze IgG si IgM.
5. Sensibilitatea testului ELISA trebuie sa fie suficient de ridicata
pentru a da o reactie pozitiva cu toate serurile active in testul de
neutralizare, precum si cu serurile pozitive de referinta furnizate de
laboratorul comunitar de referinta pentru PPC.
6. Metoda ELISA nu poate fi utilizata decat cu probe de ser sau plasma care
sa provina de la porci individuali.
7. Daca metoda ELISA nu este specifica PPC, probele pozitive trebuie sa
faca obiectul testelor diferentiale suplimentare, asa cum sunt descrise la
titlul "Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC si
alte pestivirusuri".
Evaluarea rezultatelor testelor de laborator
1. Punerea in evidenta a antigenului virusului PPC in tesuturile organelor
sau in culturi celulare dupa izolarea virusului din esantionul de tesut conform
tehnicilor descrise la titlurile: "Evidentierea antigenului viral",
"Izolarea virusului si identificarea in culturi celulare" si
"Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali"
constituie baza confirmarii prezentei bolii, in afara de cazul in care se
demonstreaza ca reactia se datoreaza virusului vaccinal definit in conformitate
cu titlul "Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor
monoclonali". Punerea in evidenta a antigenului anti-BVD/MD in
conformitate cu titlul "Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul
anticorpilor monoclonali" infirma suspiciunea de PPC, precum si faptul ca
suspiciunea nu se bazeaza pe alte cauze. In cazul unor rezultate neobisnuite
sau neasteptate ale tipizarii prin anticorpi monoclonali, conform titlului
"Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor
monoclonali", componentele de pestivirus izolate trebuie sa fie
considerate neclasificate, iar efectivul de origine este considerat suspect
pana la efectuarea altor teste. Virusul se va trimite laboratorului comunitar
de referinta in scopul caracterizarii si al realizarii anchetelor serologice in
efectivele de origine.
2. In cazul detectarii anticorpilor care reactioneaza cu virusul PPC
efectivul de origine va fi considerat suspect.
a) Pentru a infirma suspiciunea de PPC care poate sa apara prin detectarea
anticorpilor, testul descris la titlul "Teste serologice pentru
diagnosticul diferential dintre PPC si alte pestivirusuri" se utilizeaza
pentru a stabili o distinctie intre anticorpii care reactioneaza la PPC,
susceptibili de a fi indusi de alte pestivirusuri, si anticorpii virusului PPC,
indusi chiar de acesta. Toate probele originale trebuie sa faca obiectul unui
test diferential.
b) Daca suspiciunea nu poate fi exclusa cu ocazia primului test
diferential, trebuie efectuat un alt test cu cel putin 30 de zile mai tarziu,
pentru a detecta o posibila propagare a infectiei. Se vor ridica probe de la
primele 20 de animale din ferma suspecta si de la 25% dintre animalele ramase
in efectiv.
Interpretarea rezultatelor serologice
1. Un titru de neutralizare a virusului superior sau egal cu 1/10 la
oricare dintre porci, asociat cu un parametru clinic sau epizootologic care sa
permita sa se suspecteze boala, constituie un diagnostic pozitiv. Un titru
superior sau egal cu 1/10 la oricare dintre porcii care nu se asociaza cu nici
un simptom clinic sau epizootologic permite suspectarea bolii si trebuie sa fie
urmat de un diagnostic diferential.
2. Aceleasi criterii trebuie sa fie aplicate oricarui porc care prezinta un
rezultat pozitiv la testul ELISA.
Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC si alte
pestivirusuri
1. Testele pentru diagnosticul diferential intre PPC si alte infectii
induse de un pestivirus se bazeaza pe titrari in paralel ale serului,
utilizandu-se atat suse de virusuri PPC, cat si suse de virusuri BVD/MD si
folosindu-se metode strict comparabile.
a) Susele de virusuri PPC si de virusuri BVD/MD folosite au fost anterior
aprobate oficial (conform titlului "Detectarea anticorpilor antivirali ai
pestei porcine clasice"). Pentru a exclude orice suspiciune de PPC
datorata detectarii de anticorpi, esantioanele sanguine vor fi examinate prin
titrarea comparativa a anticorpilor virusului PPC si virusurilor BVD/MD.
b) In testul ELISA blocat se poate utiliza compararea dintre procentajele
inhibate de catre antigenii PPC si BVD/MD.
2. Rezultatele testelor serologice comparative care utilizeaza suse de
referinta de PPC si alte pestivirusuri vor fi interpretate astfel:
a) daca testele comparative arata ca mai mult de un porc prezinta anticorpi
ai virusului PPC, dar nici un anticorp contra altor pestivirusuri, rezultatul
testului este considerat pozitiv in ceea ce priveste PPC;
b) daca testele comparative releva ca titrurile in ceea ce priveste PPC
sunt egale sau superioare titrurilor altor pestivirusuri la mai mult de un
porc, se suspicioneaza PPC, iar diferentierea se efectueaza astfel:
1. acei porci care prezinta titruri neutralizante in ceea ce priveste
virusul PPC superioare sau egale titrurilor neutralizante ale altor
pestivirusuri vor fi sacrificati. Tesuturile lor si, daca este vorba de
gestante, fetusii vor fi supusi unei examinari pentru punerea in evidenta a
antigenului sau virusului PPC, conform procedurii descrise la titlurile:
"Evidentierea antigenului viral", "Izolarea virusului si
identificarea in culturi celulare" si "Tipajul pestivirusurilor
izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali";
2. daca se deceleaza antigenul viral sau virusul PPC, se confirma PPC;
3. daca testarea vizata la pct. 2 nu permite revelarea prezentei
antigenului virusului PPC, unitatea va fi considerata suspecta, pana cand o
noua serie de probe sanguine prelevate cu cel putin 30 de zile mai tarziu va fi
supusa unor noi teste comparative;
4. daca aceste teste comparative ulterioare arata ca toate animalele
prezinta titruri neutralizante sensibil mai mari (de 4 ori sau mai mult) contra
virusului BVD/MD/BD decat virusul PPC, suspiciunea se infirma;
5. daca unul sau mai multe animale prezinta un titru in ceea ce priveste
PPC egal sau superior titrului dat de virusul BVD/MD, rezultatul se considera
pozitiv in ceea ce priveste PPC;
c) daca titrurile in ceea ce priveste BVD/MD se prezinta astfel incat nu
putem exclude posibilitatea prezentei PPC, unitatea va fi considerata suspecta
si va fi testata din nou dupa minimum 30 de zile.
Diagnosticul diferential in pesta porcina africana
1. Pesta porcina africana (PPA) nu poate fi diferentiata de pesta porcina
clasica prin examene clinice sau postmortem. Aceste maladii trebuie luate in
considerare in diagnosticul diferential al oricarui sindrom hemoragic febril
acut la porcine. Testele de laborator sunt esentiale pentru a face diferenta
dintre cele doua maladii. Un diagnostic pozitiv intr-o tara indemna de PPA
trebuie sa se bazeze pe izolarea si identificarea virusului PPA. Baza
principala a diagnosticului de laborator in PPA trebuie sa o constituie punerea
in evidenta a virusului, antigenului viral sau a anticorpilor in organe si
secretiile tisulare. In cazul unor rezultate neconcludente sau negative, pentru
mai putin de doua teste efectuate pe esantioane din animalele suspecte de PPA
sau pe material care sa provina din ferme care au fost in contact cu cazuri de
PPA, se va preleva material suplimentar din aceeasi unitate si de la animale
care au fost in contact cu boala.
2. Evidentierea antigenului viral
Pentru evidentierea antigenului viral, pentru examinarea sectiunilor fine
criostatice din tesuturile organelor sau din materialul etalat ori a
sedimentelor culturilor leucocitare se utilizeaza tehnica de imunofluorescenta
directa sau alte tehnici asemanatoare. Metodele utilizate sunt similare celor
descrise pentru PPC, cu exceptia faptului ca se folosesc reactivi specifici
pentru PPA.
3. Izolarea si identificarea virusului
a) Testul de hemadsorbtie (HAD)
Testul de hemadsorbtie se efectueaza prin inocularea suspensiei tisulare
10% sau a sangelui colectat pe teren de la porcii suspecti in culturi
leucocitare primare de porc sau prin prepararea unor culturi leoucocitare din
sange ce provine de la porci febrili, inoculate in laborator sau prelevate pe
teren. Hemadsorbtia consta in aglutinarea unui mare numar de eritrocite de porc
la suprafata celulelor infectate si confirma diagnosticul de PPA.
b) Inocularea porcilor
Se obtine un amestec format din picaturi din suspensii tisulare 10%, din
care se inoculeaza pe cale intramusculara cate 2 ml/porc, la 4 porci, dintre
care 2 au fost vaccinati contra pestei porcine clasice si 2 nu au fost
vaccinati. In fiecare zi se ia temperatura rectala a animalelor pentru a se
constata cresterea acesteia si debutul semnelor clinice, pe o perioada de 21 de
zile. In cazul aparitiei febrei se ridica probe de sange in vederea prepararii
culturilor leucocitare destinate testului de hemadsorbtie
("autorosette" si inocularea culturilor leucocitare primare de porc).
Daca nu apare nici un simptom clinic, se iau probe de sange in scopul
detectarii de anticorpi dupa o perioada de observatie de 21 de zile.
c) Detectarea anticorpilor indusi de virusul PPA in probele de ser si in
secretiile tisulare
Detectarea anticorpilor in probele de ser sau in secretiile tisulare se
realizeaza pentru a contribui la diagnosticarea PPA in crescatoriile cu porci
care prezinta simptome clinice care permit suspectarea bolii sau la porcii
recunoscuti a fi avut un contact cu porci infectati cu PPA. Ea se poate efectua
in scopul supravegherii sau anchetarii in efectivele cu statut necunoscut.
Pentru acest scop esantioanele ridicate sunt supuse unui test aprobat. Sunt
agreate si trebuie sa se efectueze cu seruri-martor pozitive si negative
corespunzatoare urmatoarele teste:
- testul de imunofluorescenta (IFI);
- ELISA.
I. Leptospiroza
Testele pentru leptospiroza la porcine se vor efectua in conformitate cu
cap. II lit. F.
ANEXA 1
la norma sanitara veterinara
CONDITII MINIME
pentru autorizarea targurilor de animale, fermelor de carantina sau centrelor
de colectare in cazul importurilor de animale vii din speciile bovine si
porcine provenite din tari terte
1. Targurile de animale, fermele de carantina sau centrele de colectare vor
fi supravegheate de un medic veterinar oficial.
2. Fiecare targ de animale, ferma de carantina sau centru de colectare va
fi situat in centrul unei zone cu diametrul de 20 km, in care, conform
constatarilor oficiale, cu cel putin 30 de zile inaintea folosirii lor ca
targuri de animale, ferme de carantina sau centre de colectare autorizate nu
s-a inregistrat nici un caz de febra aftoasa, iar in cazul celor pentru porcine
nu s-a inregistrat nici un caz de pesta porcina, boala veziculoasa a porcului sau
encefalomielita enterovirala porcina.
3. Inainte de utilizare ele vor fi curatate si dezinfectate cu un
dezinfectant oficial autorizat de tara exportatoare ca eficient in controlul
bolilor mentionate la pct. 2.
4. Targurile de animale, fermele de carantina sau centrele de colectare, in
functie de capacitatea de cazare, trebuie sa aiba:
a) o amenajare destinata exclusiv acestui scop;
b) spatii si instalatii corespunzatoare pentru incarcarea, descarcarea si
cazarea adecvata a animalelor, la un standard corespunzator, pentru adaparea si
furajarea lor si pentru a le administra orice tratament necesar; aceste spatii
si instalatii trebuie sa fie usor de curatat si dezinfectat;
c) utilitati corespunzatoare pentru inspectie;
d) utilitati corespunzatoare pentru izolare;
e) echipament corespunzator pentru curatarea si dezinfectia incaperilor si
camioanelor;
f) o zona corespunzatoare de depozitare pentru furaje, asternut si gunoi de
grajd;
g) un sistem corespunzator pentru colectarea apei reziduale;
h) un birou pentru medicul veterinar oficial.
5. Targurile de animale, fermele de carantina sau centrele de colectare
trebuie sa fie inspectate periodic pentru a se verifica daca conditiile pentru
autorizare continua sa fie indeplinite.
6. Proprietarul sau persoana responsabila de targul de animale, ferma de
carantina sau centrul de colectare trebuie sa inscrie intr-un registru sau
intr-o baza de date care va fi pastrata pentru o perioada de minimum 3 ani
urmatoarele informatii:
a) numele proprietarului, originea, data de intrare si de iesire, numarul
de identificare a bovinelor, numarul de inregistrare a exploatatiei de origine
sau a efectivului de origine a porcilor care intra in targul de animale, ferma
de carantina sau centrul de colectare si destinatia lor;
b) numarul de inregistrare al transportatorului si numarul de autorizatie
al camionului care livreaza sau colecteaza animalele din targul de animale,
ferma de carantina sau centrul de colectare.
7. Punctele de achizitii, spatiile de incarcare sau alte spatii prin care
pot trece bovinele ori porcinele destinate exportului vor satisface conditiile
prevazute la pct. 1, 2 si 3.
8. Toate porcinele si bovinele care trec prin targul de animale, ferma de
carantina sau centrul de colectare autorizat trebuie sa fie identificate si sa
indeplineasca conditiile de sanatate stabilite pentru categoria de animale
respectiva.
9. Animalele care vor fi exportate si care trec prin targul de animale,
ferma de carantina sau centrul de colectare pot fi exportate dupa minimum 6
zile de la intrarea in ferma, daca sunt indeplinite conditiile sanitare
veterinare si se respecta urmatoarele conditii:
a) sa nu vina in contact cu animale biongulate, altele decat bovine sau
porcine care indeplinesc conditiile de sanatate stabilite pentru importul
categoriei de animale;
b) sa fie separate in transporturi astfel incat nici unul dintre ele sa nu
contina animale pentru reproductie sau productie si animale pentru taiere
imediata;
c) sa fie incarcate in vehicule de transport sau containere care au fost
initial dezinfectate cu un dezinfectant autorizat oficial in tara exportatoare,
eficient in controlul bolilor mentionate la pct. 2;
d) mijlocul de transport trebuie astfel construit incat sa nu fie posibil
ca fecalele, urina, paiele sau furajele sa curga sau sa cada din vehicule pe
durata transportului.
10. In cazul in care in conditiile pentru export de animale in perioada de
carantina se pretinde sa se efectueze un test in cadrul perioadei specificate
inainte de incarcare, acea perioada incepe o data cu ziua in care animalele au
fost introduse in ferma de carantina.
11. Tara exportatoare va autoriza targurile de animale, fermele de
carantina sau centrele de colectare pentru animale de reproductie si productie,
precum si pentru animale destinate taierii si va notifica Comisiei Europene si
autoritatilor centrale competente ale statelor membre ale Uniunii Europene
numele si adresa acestora.
12. Tara exportatoare va stabili procedura pentru supraveghere oficiala a
targurilor de animale, fermelor de carantina sau centrelor de colectare, a
bazelor de achizitie, a spatiilor de incarcare si va asigura efectuarea unei
astfel de supravegheri.
13. Tara exportatoare se asigura ca informatiile referitoare la targurile
de animale, fermele de carantina si centrele de colectare sa fie incluse in
certificatul de sanatate care insoteste animalele exportate.
14. Targurile de animale, fermele de carantina sau centrele de colectare pentru
export de bovine sau porcine din Romania catre statele membre ale Uniunii
Europene vor fi autorizate conform legislatiei nationale. Dupa autorizare o
copie de pe dosarul de autorizare, inclusiv o copie de pe autorizatie, este
inaintata autoritatii veterinare centrale a Romaniei.
15. Autoritatea veterinara centrala a Romaniei va inscrie targul de
animale, ferma de carantina sau centrul de colectare in lista oficiala si va
acorda un cod care va fi mentionat obligatoriu in certificatul de sanatate. Ferma
de carantina devine operationala din momentul comunicarii, respectiv acordarii
datelor si a codului din lista oficiala a autoritatilor veterinare judetene.
16. Romania va aviza importul de bovine si porcine din tari terte numai
daca acestea detin targuri de animale, ferme de carantina sau centre de
colectare aprobate de serviciile veterinare ale tarii respective si transmise
la Agentia Nationala Sanitara Veterinara.