ORDIN Nr. 46
din 26 februarie 2007
privind aprobarea Normei
sanitare veterinare care stabileste metode de analiza pentru controlul oficial
al furajelor cu privire la continutul de aflatoxina B1
ACT EMIS DE:
AUTORITATEA SANITARA VETERINARA SI PENTRU SIGURANTA ALIMENTE
ACT PUBLICAT IN:
MONITORUL OFICIAL NR. 236 din 5 aprilie 2007
Văzând Referatul de aprobare nr. 70.192 din 7 februarie
2007, întocmit de Direcţia de control şi coordonare a activităţii farmaceutice
veterinare din cadrul Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru
Siguranţa Alimentelor,
având în vedere prevederile
art. 10 lit. b) din Ordonanţa Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activităţii
sanitar-veterinare şi pentru siguranţa alimentelor, aprobată cu modificări prin
Legea nr. 215/2004, cu modificările şi completările ulterioare,
în temeiul art. 3 alin. (3) şi al art. 4 alin. (3) din
Hotărârea Guvernului nr. 130/2006 privind organizarea şi funcţionarea
Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor şi a
unităţilor din subordinea acesteia,
preşedintele Autorităţii Naţionale Sanitare
Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor emite
următorul ordin:
Art. 1. - Se aprobă Norma sanitară veterinară care
stabileşte metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu privire
la conţinutul de aflatoxină B1; prevăzută în anexa care face parte integrantă din prezentul ordin.
Art. 2. - Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi
pentru Siguranţa Alimentelor, institutele veterinare centrale şi direcţiile
sanitar-veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene şi a municipiului
Bucureşti vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.
Art. 3. - La data intrării în vigoare a prezentului
ordin se abrogă Ordinul preşedintelui Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranţa
Alimentelor nr. 14/2004 pentru aprobarea Normei veterinare privind metode
naţionale de analiză pentru
controlul oficial al furajelor cu referire la conţinutul în aflatoxină,
publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I,
nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004.
Art. 4. - Prezentul ordin transpune Directiva Comisiei 76/372/CEE ce stabileşte metodele naţionale de
analiză pentru controlul oficial al furajelor, publicată în Jurnalul Oficial al
Comunităţilor Europene (JOCE) nr. L 102 din 15 aprilie 1976, p. 8, aşa cum a
fost modificată ultima dată prin Directiva Comisiei 94/14/CE din 29 martie
1994, publicată în Jurnalul Oficial al Comunităţilor Europene nr. L 94 din 13
aprilie 1994, p. 30-31.
Art. 5. - Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul
Oficial al României, Partea I.
Preşedintele Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare
şi pentru Siguranţa Alimentelor,
Marian Avram
ANEXĂ
NORMĂ SANITARĂ VETERINARĂ
care stabileşte metode de analiză pentru controlul
oficial al furajelor cu privire la conţinutul de aflatoxină B1
Art. 1. - Analizele pentru controlul
oficial al furajelor cu privire la conţinutul acestora de aflatoxină B1 trebuie efectuate în conformitate
cu metodele descrise în anexa la prezenta normă sanitară veterinară.
Art. 2. - Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi
pentru Siguranţa Alimentelor informează Comisia Europeană cu privire la actele
normative şi prevederile administrative necesare pentru implementarea prezentei
norme sanitare veterinare.
ANEXĂ la norma sanitară veterinară
DETERMINAREA AFLATOXINEI B1
A. Metodă
cromatografică monodimensională în strat subţire
1. Domeniu şi scop
Metoda se utilizează pentru determinarea nivelului de
aflatoxină B1 din
materii prime şi furaje simple. Metoda poate fi aplicată numai dacă în
conţinutul acestora nu se găseşte
pulpă de citrice. Limita inferioară a determinării este 0,01 mg/kg (10 ppb).
In prezenţa substanţelor interferenţe, este necesară
repetarea analizei utilizându-se metoda B (metoda cromatografică de înaltă
performanţă în fază lichidă).
2. Principiul metodei
Proba se supune extracţiei cu
cloroform. Extractul se filtrează şi o porţiune alicotă este preluată şi
purificată pe coloana cromatografică cu silicagel. Eluatul se evaporă şi
reziduul se redizolvă într-un volum specific de cloroform sau într-un amestec
de benzen şi acetonitril.
O porţiune alicotă din această soluţie se analizează
prin cromatografie în strat subţire (CSS). Cantitatea de aflatoxină B1 se determină, sub iradierea cu UV a cromatogramei, fie vizual, fie
prin fluorodensitometrie, fie prin comparare cu cantităţi cunoscute de
aflatoxină standard B1 Identitatea aflatoxinei B1
extrasă din furaj trebuie să fie confirmată prin procedura indicată.
3. Reactivi
NB: Toţi reactivii trebuie să fie de calitate „pentru
analitiză" numai în cazul în care nu s-a stabilit altfel.
3.1. Acetonă
3.2. Cloroform, stabilizat cu 0,5 până la 1,0% etanol
96% (v/v)
3.3. n-hexan
3.4. Metanol
3.5. Eter dietilic anhidru, fără peroxizi
3.6. Amestec de benzen şi acetonitril: 98/2(v/v)
3.7. Amestec de cloroform (pct. 3.2) si metanol (pct.
3.4) 97/3(v/v)
3.8. Silicagel, pentru coloana cromatografică,
mărimea granulei 0,05 până la 0,20 mm
3.9. Vată de bumbac absorbantă, degresată anterior cu
cloroform, sau vată de sticlă
3.10. Sulfat de sodiu, anhidru, granule
3.11. Gaz inert, de exemplu azot
3.12. Acid clorhidric 1 N
3.13. Acid sulfuric 50%(v/v)
3.14. Diatomit (hyflosupercel), spălat în acid
3.15. Silicagel G-HR sau echivalent, pentru CSS
3.16. Soluţie standard cu aproximativ 0,1 µg aflatoxină B1 per ml preparată în cloroform (pct.
3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6), preparat şi verificat aşa
cum s-a indicat la secţiunea 7.
3.17. Soluţie standard pentru scopuri de testare
calitativă ce conţine aproximativ 0,1 g aflatoxină B1 şi B2 per ml în cloroform (pct. 3.2) sau amestec
de benzen/acetonitril (pct. 3.6). Aceste concentraţii sunt prezentate ca un
ghid. Acestea trebuie să fie ajustate astfel încât să se obţină aceeaşi
intensitate de fluorescentă pentru ambele aflatoxine.
3.18. Solvenţi de developare:
3.18.1. Cloroform (pct.
3.2)/acetonă (pct. 3.1): 9/1 (v/v), soluţie-mamă nesaturată;
3.18.2. Eter dietilic (pct. 3.5)/metanol (pct.
3.4)/apă: 96/3/1 (v/v/v), soluţie-mamă nesaturată;
3.18.3. Eter dietilic (pct. 3.5)/metanol (pct.
3/4)/apă: 94/4,5/1,5(v/v/v), soluţie-mamă saturată;
3.18.4. Cloroform (pct. 3.2)/metanol (pct. 3.4):
94/6(v/v), soluţie-mamă saturată;
3.18.5. Cloroform (pct. 3.2)/metanol (pct. 3.4):
97/3(v/v), soluţie-mamă saturată;
4. Aparatură
4.1. Râşniţă-mixer
4.2. Aparat de agitat sau agitator magnetic
4.3. Hârtie de filtru cutată, Schleicher şi Schull
nr. 588 sau echivalent, diametru: 24 cm.
4.4. Tub de sticlă pentru cromatografie (diametru
intern: 22 mm, lungime: 300 mm), cu un robinet PTFE şi un rezervor de 250 ml
4.5. Rotovapor, prevăzut cu un
balon cu fund rotund de 500 ml
4.6. Balon conic de 500 ml, cu buşon rodat de sticlă
4.7. Aparatură pentru CSS
4.8. Plăci de sticlă pentru CSS, 200 x 200 mm,
preparate după cum urmează (cantităţile indicate sunt suficiente pentru a
acoperi cinci plăci): se pun 30 g silicagel G-HR (3.15) într-un balon conic; se
adaugă 60 ml apă, se astupă şi se agită timp de un minut. Se împrăştie
suspensia pe plăci astfel încât să se obţină un strat uniform de grosime 0,25
mm; se lasă să se usuce la aer şi apoi se depozitează într-un exicator ce
conţine silicagel. In momentul utilizării, se activează plăcile prin ţinerea
acestora în cuptor la 110°C timp de o oră.
4.9. Lampă UV cu lungime de undă lungă (360 nm).
Intensitatea iradierii trebuie să facă posibilă, pentru un spot de 1 ng de
aflatoxină B1;
distingerea cu claritate pe o placă CSS la o distanţă de 10 cm de lampă.
4.10. Eprubete gradate de 10 ml cu dopuri de
polietilenă
4.11. Spectrofotometru UV
4.12. Fluorodensitometru (opţional)
5. Procedură
5.1. Prepararea probei (vezi
„Observaţii", partea C, pct. 1).
Se macină proba astfel încât întreaga cantitate să
treacă printr-o sită cu ochiuri de 1 mm (în conformitate cu recomandarea ISO R
565).
5.2. Extracţie
Se pun 50 g de probă măcinată, omogenizată într-un tub
conic de 500 ml. Se adaugă 25 g de diatomit (3.14), 25 ml de apă şi 250 ml de cloroform
(pct. 3.2). Se astupă balonul, se agită timp de 30 de minute cu aparatul (4.2)
şi se filtrează printr-o hârtie de filtru cutată (pct. 4.3). Se înlătură primii
10 ml din filtrat şi apoi se colectează 50 ml.
5.3. Curăţarea coloanei
Se introduce în capătul inferior al unui tub de
cromatografie (pct. 4.4) un dop de vată de bumbac sau de sticlă (pct. 3.9), se
umplu două treimi din tub cu cloroform (pct. 3.2) şi se adaugă 5 g de sulfat de
sodiu (pct. 3.10).
Se verifică dacă suprafaţa superioară a stratului de
sulfat de sodiu este netedă, apoi se adaugtă 10 g de silicagel (pct. 3.8) în
porţiuni mici. Se agită cu atenţie după fiecare adăugare, pentru a elimina
bulele de aer. Se lasă în repaus timp de 15 minute şi apoi se adaugă cu atenţie
15 g de sulfat de sodiu (pct. 3.10). Se lasă lichidul să curgă până când acesta
ajunge deasupra suprafeţei superioare a stratului de sulfat de sodiu.
Se amestecă 50 ml de extract colectat (pct. 5.2) cu 100
ml de n-hexan (pct. 3.3) şi se transferă cantitativ amestecul pe coloană. Se
lasă lichidul să curgă până când acesta este exact deasupra suprafeţei
superioare a stratului de sulfat de sodiu. Lichidul colectat se elimină. Apoi
se adaugă 100 ml de eter dietilic (pct. 3.5) şi se lasă din nou să curgă până
la suprafaţa superioară a stratului de sulfat de sodiu. In timpul acestor
operaţiuni debitul trebuie să fie de 8 până la 12 ml per minut şi coloana nu
trebuie să se usuce. Se elimină lichidul care curge. Se eluează apoi cu 150 ml
amestec de cloroform/metanol (pct. 3.7) şi se colectează întregul eluat. Acesta
se evaporă până aproape de uscare la o temperatură ce nu depăşeşte 50°C şi sub
un jet de gaz inert (pct. 3.11) cu rotovapor (pct. 4.5). Se transferă
cantitativ reziduul, utilizându-se cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen-acetonitril
(pct. 3.6), într-o eprubeta gradată de 10 ml (pct. 4.10). Se concentrează
soluţia sub un jet de gaz inert (pct. 3.11) şi apoi se
ajustează volumul până la 2 ml cu cloroform (pct. 3.2)
sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6).
5.4. Cromatografia în strat subţire
Pe placa cromatografică (pct. 4.8) se aplică spoturi,
la 2 cm de la marginea inferioară, la intervale de 2 cm, cu volumele indicate
mai jos din soluţia standard şi din extract:
a) 10, 15, 20, 30 şi 40 µl din soluţia standard de aflatoxină B1 (pct. 3.16);
b) 10 µl din extractul obţinut
la pct. 5.3 şi, suprapunându-se pe acelaşi punct, 20 µl
de soluţie standard (3.16);
c) 10 şi 20 µl de extras obţinut la pct. 5.3.
Se developează cromatograma la întuneric folosind unul
din solvenţii de developare (pct. 3.18). Alegerea solventului trebuie să fie
efectuată în prealabil, prin depozitarea a 25 µl de soluţie standard calitativă (pct. 3.17) pe placă. Atunci când se
developează cromatograma la întuneric, aflatoxinele B1 şi B2 trebuie să fie complet separate.
Solvenţii se lasă să se evapore la întuneric, după care
placa cromatografică plasată la 10 cm de lampă (pct. 4.9) se iradiază cu UV.
Spoturile de aflatoxină B1 dau o fluorescentă albastră.
5.5. Determinări cantitative
Se determină fie vizual, fie prin fluorodensitometrie,
aşa cum este indicat mai jos.
5.5.1. Măsurători vizuale
Se determină cantitatea de aflatoxină B1 din extract, prin compararea intensităţii fluorescentei din spoturile de extract cu cea a
unuia din spoturile soluţiei standard. Dacă este necesar, se interpolează.
Fluorescenta obţinută prin suprapunerea extractului din soluţia standard
trebuie să fie mai intensă decât cea a cantităţii de 10 µl de extract şi trebuie să fie mai mică
decât un spot vizibil. Dacă intensitatea fluorescentei dată de cantitatea de 10
µl de extras este mai mare decât cea de 40 µl din soluţia standard, se diluează extractul de 10 sau 100 de ori cu
cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6) înainte să
fie supus din nou cromatografiei în strat subţire.
5.5.2. Măsurători prin fluorodensitometrie
Intensitatea fluorescentei spoturilor de aflatoxină B1 se măsoară
cu fluorodensitometru (pct. 4.12), la o excitaţie cu lungime de undă de 365 nm
şi o emisie cu lungime de undă de 443 nm. Cantitatea de aflatoxină B1 din spoturile de extract se
determină prin compararea intensităţilor fluorescentei acestora cu cea a
spoturilor de aflatoxină B1 standard.
5.6. Confirmarea identităţii aflatoxinei B1 Confirmarea identităţii
aflatoxinei B1 din
extract se efectuează prin procesele indicate mai jos.
5.6.1. Tratare cu acid sulfuric
Se pulverizează acid sulfuric (pct. 3.13) pe
cromatograma obţinută la pct. 5.4. Fluorescenta spoturilor de aflatoxină B1 trebuie să se schimbe, sub
iradierea UV, din albastră în galbenă.
5.6.2. Cromatografie bidimensională implicând
formarea de aflatoxină B-hemiacetat (aflatoxină B2a)
NB: Operaţiunile descrise mai jos trebuie să fie
efectuate urmând cu atenţie diagrama din figura 3.
5.6.2.1. Aplicarea soluţiilor
Pentru a preveni migrarea fronturilor solventului se
trasează pe o placă (pct. 4.8) două linii drepte paralele la două părţi
marginale (6 cm de fiecare parte). Se marchează soluţiile următoare pe placă
utilizându-se pipete capilare sau microseringi:
- în punctul A: un volum al probei de extract
purificat, obţinută la pct. 5.3, conţinând aproximativ 2,5 nm aflatoxină B.,;
- în punctele B si C: 25 µl de
soluţie standard (pct. 3.16).
5.6.2.2. Developare
Se developează cromatograma în direcţia I, la întuneric, utilizând solvent de
developare (pct. 3.18.1) (un strat de 1 cm dintr-o soluţie-mamă nesaturată)
până când frontul de solvent atinge linia limită a solventului.
Se îndepărtează soluţia-mamă de
pe placă şi se lasă să se usuce la întuneric, la temperatura ambiantă, timp de
5 minute. Se pulverizează apoi cu acid clorhidric (pct. 3.12) de-a lungul unei
benzi de 2,5 cm înălţime, ce acoperă punctele A şi B (indicată prin zona
haşurată în figura 3) până se înnegreşte, protejând restul plăcii cu o foaie de
sticlă. Se lasă să reacţioneze timp de 10 minute la întuneric şi se usucă cu un
curent de aer la temperatură ambiantă.
Se developează apoi cromatograma în direcţia II, la întuneric, utilizând solvent de
developare (pct. 3.18.1) (un strat de 1 cm dintr-o soluţie-mamă nesaturată)
până când frontul de solvent ajunge la linia limită a solventului. Se
îndepărtează soluţia-mamă de pe placă şi se lasă să se usuce la temperatura
ambiantă.
5.6.2.3. Interpretarea cromatogramei
Se examinează cromatograma sub lumină UV (pct. 4.9) şi
se verifică următoarele caracteristici:
a) apariţia unui spot albastru de aflatoxină B1 ce provine de la soluţia standard
aplicată în punctul C (migrare în direcţia I);
b) apariţia unui spot fluorescent albastru de
aflatoxină B1 (nu
reacţionează cu acid clorhidric) şi un spot fluorescent albastru mai intens de
aflatoxină B-hemiacetat, ambele originare din soluţia standard aplicată în
punctul B (migrarea în direcţia II);
c) apariţia de spoturi asemănătoare celor descrise la
lit. b) ce provin din extractul din proba aplicată în punctul A. Poziţia
acestor spoturi este definită mai întâi prin distanţa de migrare a aflatoxinei
B1 de la punctul A
în direcţia I (aceeaşi ca
aceea lucrată prin standardul aplicat la C) şi apoi prin distanţele de migrare
de acolo în direcţia II a
aflatoxinei B-hemiacetat (aceeaşi ca acelea lucrate prin standardul aplicat la
B). Intensităţile fluorescentei spoturilor hemiacetate ce provin din extract şi
din standardul aplicat în punctul B trebuie să se potrivească.
6. Calcularea rezultatelor
6.1. De la măsurătorile vizuale
Conţinutul în micrograme de aflatoxină B1 per kg de probă (ppb) se determină
utilizând următoarea formulă:
C x Y x V
m x X
în care:
Y şi X = volumele în microlitri ale soluţiei standard de aflatoxină B1 (pct. 3.16) şi ale extractului
având o intensitate a fluorescentei similară;
C = concentraţia în micrograme de aflatoxină B1 per ml în soluţia standard (pct. 3.16);
V = volumul final al
extractului în microlitri, permiţând orice diluţie ce a fost necesară;
m = masa în grame a probei corespondente volumului din
extractul supus la curăţarea coloanei.
6.2. De la măsurătorile fluorodensitometrice Conţinutul
în micrograme de aflatoxină B1 per kg de probă se determină utilizând următoarea formulă:
C x V
m x Y
în care:
Y = volumul în microlitri de extract depus pe placă
(10 sau 20 I);
C = cantitatea în nanograme de aflatoxină B1 din spotul de extras (proporţional
valorii Y luate), dedusă din măsurători;
V = volumul final al
extractului în microlitri, permiţând orice diluţie ce a fost necesară;
m = masa în grame a probei corespondente volumului din
extractul supus la curăţarea coloanei.
7. Prepararea şi
testarea soluţiei standard (pct. 3.16)
7.1. Determinarea concentraţiei de aflatoxină B1
Se prepară o soluţie standard de aflatoxină B1 în cloroform (pct. 3.2) sau amestec
de benzen/acetonitril (pct. 3.6) cu o concentraţie de 8 la 10 µg/ml.
Se determină spectrul de absorbţie între lungimile de
undă de 330 si 370 nm cu ajutorul spectrofotometrului (pct. 4.11).
Se măsoară densitatea optică (A) la lungimea de undă de
363 nm, în cazul soluţiei de cloroform, sau la lungimea de undă de 348 nm, în
cazul soluţiei de amestec de benzen/acetonitril.
Pentru soluţia de cloroform, concentraţia în micrograme
de aflatoxină B1/ml
de soluţie se calculează utilizând formula:
312 x A x 1.000
20.600
Pentru soluţia formată din amestecul
benzen/acetonitril, concentraţia în micrograme de aflatoxină B1/ml de soluţie se calculează
utilizând formula:
312 x A x 1.000
19.800
Se diluează după cum este corespunzător, ferit de
lumina zilei, pentru a obţine o soluţie de lucru standard, cu o concentraţie de
aflatoxină B1 de
aproximativ 0,1 µg/ml. Această soluţie este stabilă
timp de două săptămâni dacă se păstrează într-un refrigerator la 4°C.
7.2. Testarea purităţii cromatografice
Se depun pe o placă (pct. 4.8)
µl soluţie standard de aflatoxină B1 ce conţine 8 până la 10 µg/ml (pct. 7.1). Se developează
cromatograma aşa cum s-a indicat la pct. 5.4. In lumina UV cromatograma trebuie
să indice numai un spot şi nu trebuie să fie perceptibilă în zona de depozitare
originală nicio fluorescentă.
8. Repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări
paralele, efectuate pe aceeaşi probă, prin aceeaşi analiză, trebuie să fie de
maximum:
- 25%, corelată cu rezultatul cel mai mare pentru un
conţinut de aflatoxină B1 de la 10 şi până la 20 µg/kg;
- 5 µg, în valoare absolută,
pentru un conţinut mai mare de 20 şi până la 50 µg/kg;
- 10%, corelată cu valoarea cea mai mare pentru un
conţinut mai mare de 50 µg/kg.
9. Reproductibilitate
A se vedea „Observaţii", partea C, pct. 2.
B. Metoda cromatografică de înaltă performantă în fază lichidă (HPLC)
1. Domeniu şi scop
Metoda se utilizează pentru determinarea nivelului de
aflatoxină B1 din
furaje, incluzându-le şi pe cele care conţin pulpă de citrice. Limita
inferioară a determinării este 0,001 mg/kg (1ppb).
2. Principiu
Proba se supune extracţiei de
cloroform. Extractul se filtrează şi o parte alicotă se purifică printr-un
cartuş de florisil şi apoi printr-un cartuş C18. Separarea finală şi determinarea sunt realizate cu ajutorul
metodei cromatografice de înaltă performanţă în faza lichidă (HPLC), utilizând faza inversă cu
coloană C18, urmată
de derivatizare postcoloană cu iod în apă şi detectare fluorescentă.
Deoarece micotoxinele sunt substanţe extrem de toxice,
manipularea trebuie să fie efectuată într-un spaţiu cu abur şi trebuie luate
precauţii speciale în cazul în care toxinele sunt în formă uscată datorită
caracterului electrostatic al acestora şi tendinţei de a se dispersa în mediul
de lucru.
3. Reactivi
3.1. Cloroform, stabilizat cu etanol 0,5 până la 1%,
din masă. A se vedea observaţia pct. 10.2;
3.2. Metanol pentru HPLC;
3.3. Acetonă;
3.4. Acetonitril pentru HPLC;
3.5. Solvenţi pentru eluare: se prepară cu o zi
înainte sau îndepărtaţi ultrasonic aerul din solvenţi.
3.5.1. Amestec de acetonă (pct. 3.3) şi apă, 98 + 2(v
+ v).
3.5.2. Amestec de apă şi metanol (pct. 3.2), 80+20(v+v).
3.5.3. Amestec de apă şi acetonă (pct. 3.3),
85+15(v+v).
3.6. Faza mobilă pentru HPLC
Amestec de apă, metanol (pct. 3.2) si acetonitril (pct.
3.4), 130+70+40(v+v+v).
NB: Compoziţia solventului
pentru faza mobilă poate avea nevoie să fie ajustată în funcţie de coloana HPLC
folosită.
3.7. Soluţie de iod saturată: se adaugă 2 g la 400 ml
apă. Se amestecă cel puţin 90 min. şi se filtrează printr-o membrană filtrantă
(pct. 4.15). Se protejează de lumină pentru a preveni fotodegradarea.
3.8. Celit 545 spălat în acid sau echivalent
3.9. Cartuş de florisil (ape SEP-PAK) sau echivalent
3.10. Cartuş C18 (ape SEP-PAK) sau echivalent
3.11. Gaz inert, de exemplu azot
3.12. Aflatoxină B1 soluţie standard în cloroform, concentraţie 10 µg/ml. Se verifică concentraţia soluţiei,
după cum urmează: se determină spectrumul de absorbţie a soluţiei între 330 şi
370 nm cu ajutorul spectrofotometrului (pct. 4.23). Se măsoară absorbanta (A)
la un maxim aproape de 363 nm. Se calculează concentraţia de aflatoxină B1 în micrograme per mililitru de
soluţie, utilizând formula:
Concentraţia (emg/ml) = 312 x A x 1.000 = 13,991 x A
22.300
3.12.1. Aflatoxină B1 soluţie pastă standard în cloroform Se transferă cantitativ 2,5 ml
aflatoxină B1
soluţie standard (pct. 3.12) într-un balon cotat de 50 ml şi se aduce la semn
cu cloroform (pct. 3.1). Se depozitează soluţia într-un loc răcoros (4°C),
întunecat, bine sigilat şi învelit în folie de
aluminiu.
3.13. Aflatoxină B1 soluţii de calibrare HPLC
NB: Pentru pregătirea soluţiilor se foloseşte sticlă
spălată cu acid (a se vedea pct. 4, Aparatură).
3.13.1. Soluţie calibrare 4 ng/ml
Se lasă balonul cotat cu soluţie standard (pct. 3.12.1)
în folia de aluminiu să se încălzească la temperatura camerei (câteva ore). Se
transferă cei 400 µl soluţie
pastă standard (200 ng aflatoxină B1) într-un balon cotat de 50 ml şi se
evaporă până la uscare într-un curent de gaz inert (pct. 3.11).
Se dizolvă reziduul obţinut în
aproximativ 20 ml amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3.), se adaugă amestec
apă/acetonă până la semn şi se amestecă bine.
3.13.2. Soluţie pentru calibrare 3 ng/ml
Se transferă cantitativ 7,5 ml soluţie de calibrare
(pct. 3.13.1) într-un balon cotat de 10 ml, se completează până la semn cu
amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3) şi se amestecă bine.
3.13.3. Soluţie pentru calibrare 2 ng/ml
Se transferă cantitativ 25 ml soluţie de calibrare
(pct. 3.13.1) într-un balon volumetric de 50 ml, se completează până la semn cu
amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3) şi se amestecă bine.
Această soluţie este, de asemenea, indicată ca standard
de referinţă, pentru a fi utilizată în cazul injectărilor repetitive în timpul
HPLC (pct. 5.5).
3.13.4. Soluţie pentru calibrare
1 ng/ml
Se transferă cantitativ 2,5 ml soluţie de calibrare
(pct. 3.13.1) într-un balon volumetric de 10 ml, se completează până la semn cu
amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3) şi se omogenizează.
3.14. Fiolă conţinând amestec de aflatoxine B1, B2,
G1 şi G2 cu concentraţia aproximativă de 1, 0,5, 1 şi, respectiv, 0,5 µg/ml în 1 ml cloroform
3.14.1 Soluţie pentru test cromatografie
Se transferă conţinutul fiolei (pct. 3.14) într-un
flacon cu opritor din sticlă sau cu capac cu filet. Se transferă 40 µl soluţie în tubul de test cu opritor din
sticlă (clătit cu acid) (pct. 4.22). Se evaporă cloroformul în curent de gaz
inert (3.11) si se dizolvă din nou în 10 ml amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3).
3.15. Reactivi pentru testul de confirmare (6)
3.15.1. Soluţie saturată de
clorură de sodiu
3.15.2. Sulfat de sodiu, anhidru, granulat
4. Aparatură
Atenţie! Utilizarea
sticlei fără a fi spălată cu acid pentru soluţii apoase de aflatoxină poate
cauza pierderi. Trebuie să fie acordată atenţie deosebită obiectelor din sticlă
noi şi celor de unică folosinţă, precum şi flacoanelor autoprelevatoare şi
pipetelor Pasteur. Obiectele de laborator din sticlă ce au intrat în contact cu
soluţii apoase de aflatoxină trebuie să fie lăsate câteva ore în acid slab (de
exemplu acid sulfuric = 2 mol/l), iar apoi trebuie să fie clătite cu apă
distilată, pentru a se îndepărta toate urmele de acid (de exemplu de trei ori,
verificare cu hârtie pH). In practică, acest tratament este necesar pentru
baloanele cu fund rotund (pct. 4.4), baloane cotate, cilindri de măsurare,
flacoane sau tuburi folosite pentru soluţii de calibrare şi extracte finale (în
special flacoane pentru autoprelevare) şi pipete Pasteur, dacă acestea sunt
folosite pentru transferul soluţiilor de calibrare sau al extractelor.
4.1. Râşniţă-mixer
4.2. Sită cu orificii de 1,0 mm, (ISO R 565)
4.3. Agitator mecanic
4.4. Evaporator rotativ în vacuum, echipat cu balon
cu fund rotund de 150 până la 250 ml
4.5. Injector pentru cromatografie cu lichid de
înaltă performanţă cu deschidere potrivită pentru injecţia a 250 ml. A se
urmări instrucţiunile producătorului pentru umplerea parţială sau completă a
deschiderii.
4.6. Coloană de analiză HPLC: pachet C18 3 µm sau 5 µm
4.7. Pompă fără pulsaţie pentru reactiv post-coloană
de iod
4.8. Piesă în formă de T pentru volume moarte zero,
inox (1/16" x 0,75 mm)
4.9. Bobină spiralată de reacţie; teflon sau inox.
Dimensiunile de 3000 x 0,5 mm
până la 5000x0,5 mm sunt cele mai potrivite în combinaţie cu coloane HPLC de 5 µm sau 3 µm.
4.10. Baie de apă controlată termostatic, ajustată la
60°C, cu posibilitate de reglare a temperaturii mai bună de 0,1 °C
4.11. Detector de fluorescentă, cu excitaţia la
lungime de undă 365 nm şi emisia la 435 nm. (Pentru instrument de filtrare:
lungimea de undă a emisiei > 400 nm). Trebuie să fie posibilă detectarea a
cel puţin 0,05 ng aflatoxină B1 Unele presiuni pot fi recomandate (de exemplu, reductor, bobină din
teflon sau inox conectată la borna de ieşire a detectorului), pentru a suprima
bulele de aer din celula de flux.
4.12. Dispozitiv de înregistrare
4.13. Integrator electronic (opţional)
4.14. Hârtie filtru cutată cu diametrul de 24 cm,
Macherey-Nagel 617 1/4 sau echivalent
4.15. Membrană filtrantă cu dimensiunea porilor de
0,45 µm, Millipore HAWP
04700 sau echivalent
4.16. Balon conic de 500 ml cu opritor din sticlă
4.17. Coloană din sticlă (diametru interior de
aproximativ 1 cm, lungime de aproximativ 30 cm) echipat cu vârf Luer
4.18. Robinet de închidere Luer rezistent la cloroform
(de exemplu, Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, JT. Baker 4514 sau
echivalent)
4.19. Seringă rezistentă chimic, racord Luer de 10 ml
4.20. Seringă potrivită pentru injecţie HPLC de 250 µl (a se vedea pct. 4.5)
4.21. Microseringă de 100 µl
pentru prepararea soluţiilor de calibrare (se verifică
prin cântărire ca precizia să fie de aproximativ 2%)
4.22. Tuburi calibrate de 10 ml cu opritor din sticlă
4.23. Spectrofotometru, potrivit pentru măsurători în
regiunea spectrală UV
4.24. Echipament pentru testul de confirmare (6)
4.24.1. Pâlnie pentru separare de 100 µl cu robinet de închidere din teflon, spălată cu acid
4.24.2. Bloc pentru încălzire, 40 până la 50°C
5. Procedură
5.1. Prepararea probei
Se macină proba până ce trece prin sită (pct. 4.2).
5.2. Porţia pentru test
Se cântăresc 50 g din proba preparată în balonul conic
(pct. 4.16).
5.3. Extracţie
Se adaugă la porţia pentru test 25 g celit (pct. 3.8),
250 ml cloroform (pct. 3.1) şi 25 ml apă. Se astupă balonul şi se agită 30 de
minute cu un agitator mecanic (pct. 4.3). Se filtrează prin hârtie filtru cu
caneluri (pct. 4.14). Se colectează 50 ml filtrat. Este necesară prelevarea
unei alicote din filtrat şi diluarea până la 50 ml cu cloroform, astfel încât
concentraţia de aflatoxină B1 să nu fie mai mare de 4 ng/ml.
5.4. Curăţare:
Procedura trebuie să fie efectuată fără întreruperi
semnificative.
Atenţie!
- laboratorul în care
sunt făcute analizele trebuie protejat adecvat de lumina zilei prin utilizare
de:
(i) folie absorbantă UV pe ferestre în combinaţie cu lumină slabă (fără raze solare);
(ii) perdele sau jaluzele în combinaţie cu lumină
artificială (tuburile fluorescente sunt acceptate);
- soluţiile ce conţin aflatoxină trebuie protejate de
lumină şi este indicat a se păstra la întuneric
utilizându-se folie de aluminiu.
5.4.1. Purificare Florisil SEP-PAK
5.4.1.1. Pregătirea ansamblului coloană-cartuş
Se montează un robinet de închidere (pct. 4.18) la tija
scurtă a cartuşului de florisil (pct. 3.9) (a se vedea figura 1). Se spală
cartuşul şi se elimină aerul luând 10 ml cloroform (pct. 3.1) şi trecând repede
8 ml prin robinetul de închidere în cartuş, utilizând o seringă (pct. 4.19). Se
montează tija lungă a cartuşului la coloana din sticlă (pct. 4.17) şi se trec
cei 2 ml cloroform rămaşi prin cartuş în coloană. Se închide robinetul. Se
extrage seringa.
5.4.1.2. Purificare
Se adaugă filtratul colectat la pct. 5.3 la ansamblul
coloană-cartuş şi se lasă să se scurgă. Se spală cu 5 ml cloroform (pct. 3.1),
apoi cu 20 ml metanol (pct. 3.2). Se îndepărtează eluatul. In timpul acestor
operaţiuni, se asigură faptul că ansamblul coloană-cartuş nu se usucă.
Se eluează aflatoxină B1 cu 40 ml amestec acetonă-apă (pct. 3.5.1) şi se colectează
întregul eluat în balonul cu fundul rotund al evaporatorului rotativ (pct.
4.4). Se concentrează eluatul pe evaporatorul rotativ la 40°C până la 50°C până
ce nu se mai distilează acetona. (NB: In acest punct rămân în balon aproximativ
0,5 ml lichid. Experimentele au arătat că după acest punct evaporarea nu mai
este necesară, şi atunci când rămâne o cantitate de lichid de 0,5 ml acetona nu
reprezintă o cantitate semnificativă. Reziduurile de acetonă rămase pot cauza
pierderi de aflatoxină B1 la nivelul cartuşului C18.) Se adaugă 1 ml metanol (pct. 3.2), se agită circular balonul
pentru a dizolva aflatoxină B1 pe lateralul balonului, se adaugă 4 ml apă şi se amestecă. Se
deconectează şi se îndepărtează cartuşul. Se clăteşte coloana de apă şi se
păstrează pentru etapa de purificare a cartuşului C18.
5.4.2. Purificare C18 SEP-PAK
5.4.2.1. Pregătirea ansamblului coloană-cartuş
Se montează un robinet de închidere la tija scurtă a
cartuşului C18
(pct. 3.10) - figura 1. Se pregăteşte cartuşul şi se elimină orice bulă de aer
prin trecerea rapidă cu o seringă (pct. 4.19) a 10 ml metanol (pct. 3.2) prin
robinet în cartuş (Bulele de aer din cartuş se văd ca petele de lumină pe fond
întunecat). Se iau 10 ml apă şi se trec 8 ml prin cartuş (A se evita
pătrunderea aerului în cartuş în momentul înlocuirii metanolului cu apa). Se
montează tija lungă a cartuşului la o coloană de sticlă (pct. 4.17) şi se trec
cei 2 ml apă rămaşi prin cartuş în coloană. Se închide robinetul. Se extrage
seringa.
5.4.2.2. Purificare
Se transferă cantitativ extractul colectat la pct.
5.4.1.2. în coloana de sticlă (pct. 4.17), spălând balonul cu 5 ml amestec
apă/metanol (pct. 3.5.2.), lăsând să se scurgă. In timpul acestor operaţiuni se
asigură faptul că ansamblul coloană-cartuş nu se usucă. (In momentul în care
bulele de aer se strâng lângă cartuş se opreşte curgerea şi se îndepărtează
partea de sus a coloanei de sticlă pentru a elimina bulele de aer. Se
continuă.) Se elutează cu 25 ml amestec apă/metanol. Se elimină eluatul. Se elutează aflatoxină B1 cu 50 ml amestec apă/acetonă (pct.
3.5.3) şi se colectează tot eluatul într-un balon cotat de 50 ml. Se
completează cu apă până la semn şi se amestecă: soluţia de test rezultată este
utilizată pentru cromatografie (pct. 5.5).
Atenţie! Filtrarea
extractului final anterioară HPLC nu este obligatorie. Dacă se consideră
necesar filtrele din celuloză nu trebuie să fie folosite deoarece pot produce
pierderi de aflatoxină B1 Sunt acceptate filtrele din teflon.
5.5. Cromatografia de înaltă performanţă cu lichid
(A se vedea figura 2 pentru setarea echipamentului). A se lăsa suficient timp pentru condiţionarea şi
stabilizarea instrumentelor.
nota 1: Debitul de curgere dat
de faza mobilă şi de reactivul post-coloană are numai rol indicativ şi poate fi
ajustat în funcţie de caracteristicile coloanei HPLC.
nota 2: Răspunsul detectorului
la aflatoxină B1
depinde de temperatură, prin urmare derivaţiile trebuie compensate (fig. 3).
Prin injectarea unei cantităţi fixe de standard de referinţă aflatoxină B1 (pct. 3.13.3) la intervale regulate
(de exemplu, la fiecare a treia injectare), valorile picului aflatoxinei B1 obţinute între aceste standarde de referinţă pot fi corectate
utilizând mijloace de răspuns, cu condiţia ca diferenţa dintre răspunsurile
standardelor de referinţă consecutive să fie foarte mică (<10%). De aceea,
injectările trebuie să fie efectuate fără întrerupere. Dacă este necesară o
întrerupere, ultima injectare înainte de întrerupere şi prima injectare după
întrerupere trebuie să reprezinte standardul de referinţă (pct. 3.13.3).
Intrucât curba de calibrare
este lineară şi trece prin origine, cantităţile de aflatoxină B1 din extractele din probe sunt
determinate direct prin raportare la standardele adiacente.
5.5.1. Setările pompei HPLC
Se setează pompa HPLC (pct. 4.5) la un debit de curgere
de 0,5 sau 0,3 ml/min. pentru o coloană HPLC (pct. 4.6) de 5 µm sau de 3 f/m, respectiv folosind faza
mobilă (pct. 3.6).
5.5.2. Setările pompei post-coloană
Se setează pompa (pct. 4.7) la un debit de curgere de
0,2 până la 0,4 ml/min. pentru soluţie saturată apă-iod. Debite de aproximativ
0,4 sau 0,2 ml/min. sunt recomandate în combinaţie cu debite de 0,5, respectiv
0,3 ml/min. pentru faza mobilă (pct. 3.6).
5.5.3 Detector cu fluorescentă
Se setează detectorul cu fluorescentă (pct. 4.11) la
excitaţie de 365 nm şi emisie de 435 nm (instrument de filtrare; > 400 nm).
Se ajustează atenuatorul detectorului pentru a obţine aproximativ 80% din
totalul devierii vârfului dispozitivului de înregistrare pentru 1 ng de
aflatoxină B1
5.5.4. Injector
Pentru toate soluţiile se injectează o cantitate de 250
µl, urmând instrucţiunile
producătorului injectorului.
5.5.5. Verificarea separării cromatografice
Se injectează soluţia pentru test cromatografie (pct.
3.14.1). Şanţurile trebuie să fie mai mici de 5% din suma înălţimilor muchiilor adiacente.
5.5.6. Verificarea stabilităţii sistemului
Inaintea fiecărei serii de analize se injectează
standardul de referinţă (pct. 3.13.3) până ce se ating suprafatele stabile ale
muchiilor. (NB: Reacţia suprafeţei de aflatoxină B1; între injectări consecutive, nu trebuie să
difere cu mai mult de 6%). Se începe imediat verificarea linearităţii (pct.
5.5.7).
5.5.7. Verificarea linearităţii
Se injectează soluţie de calibrare aflatoxina B1 (pct. 3.13.1 la pct. 3.13.4).
Pentru evitarea aglomerărilor în reacţie, la fiecare a
treia injectare se va utiliza standard de referinţă (pct. 3.13.3) (NB: Reacţia
suprafeţei superioare în cazul acestui standard de referinţă nu trebuie să
difere cu mai mult de 10% în 90 min.). Se corectează aglomerările conform formulei
de la punctul 7. Graficul de calibrare trebuie să fie linear şi să treacă prin
origine între două erori standard pe Y. Valorile obţinute nu trebuie să difere
cu mai mult de 3% de valorile nominale. Dacă aceste condiţii sunt îndeplinite,
se continuă fără întârziere. Dacă nu, se identifică şi se corectează sursa
problemelor de a continua.
5.5.8. Injectarea extractelor din probe
Se injectează extractele din probe purificate (pct.
5.4.2.2). După fiecare două extracte din probe se repetă injectarea de standard
de referinţă (pct. 3.13.3), conform următoarei secvenţe: standard de referinţă,
extract, extract, standard de referinţă, extract, extract, standard de
referinţă etc.
6. Test de confirmare
6.1. Tratarea în continuare a extractului (pct.
5.4.2.2) Se adaugă 5 ml soluţie de
clorură de sodiu
(pct. 3.15.1) extractului obţinut la pct. 5.4.2.2. Se
extrag de 3 ori câte 2 ml cloroform (pct. 3.1) pentru un minut, în pâlnia de
separare (pct. 4.24.1). Se scurg extractele combinate cu cloroform peste
aproximativ 1 g sulfat de sodiu (pct. 3.15.2) într-un tub pentru test de 10 ml.
O pâlnie mică (diametru: 4 cm, poate fi folosită împreună cu o cârpă din bumbac
în partea de scurgere, acoperită cu aproximativ 1 g sulfat de sodiu.
Se spală stratul de sulfat de sodiu cu câţiva ml
cloroform şi se colectează soluţia rezultată în acelaşi tub pentru test. Se
evaporă extractul de cloroform până la uscare, în acelaşi tub pentru test,
utilizând un bloc pentru încălzire (pct. 4.24.2) şi se redizolvă în 1 ml cloroform.
6.2. Pregătirea cromatografiei derivate şi în strat
subţire: A se vedea metoda A, pct. 5.6.2.
7. Calcularea rezultatelor
Se calculează conţinutul de aflatoxina B1 (µm/kg)
prezent în probă, după formula:
Conţinutul de
aflatoxina B1 în
emg/kg = m x Vext ,
Vm x M x Vf
Vc
unde:
m = cantitatea în ng de aflatoxina B1 reprezentată prin partea superioară B1 a probei, calculată după cum urmează:
m = P(proba) x 2r(st),
P(st1) + P(st2)
unde:
P(proba) = suprafaţa superioară a aflatoxinei B1 pentru probă;
P(st.1) = suprafaţa
superioară a aflatoxinei B1 rezultată din injectarea precedentă, cu standard de referinţă
(pct. 3.13.3);
P(st2) = suprafaţa
superioară a aflatoxinei B1 rezultată din injectarea următoare, cu standard de referinţă (pct.
3.13.3);
r(st) = cantitatea de aflatoxina B1 în ng injectată în standardul de referinţă (pct. 3.13.3);
Vm = volumul în ml
extras din probă injectat;
Vext = volumul final
în ml de extras din probă;
M = masa în g a probei;
Vf = volumul în ml
de filtrat transferat în cartuşul florisil (pct. 5.4.1.2);
Vc = volumul în ml de cloroform utilizat pentru
extragerea probei.
Dacă procedura este conformă acestui protocol, formula
se reduce la:
conţinutul de aflatoxina B1
în µg/kg = 20 x m.
7.1. Calcularea rezultatelor poate, de asemenea, să fie
efectuată măsurând înălţimea suprafeţei superioare.
8. Repetabilitate
A se vedea pct. 10.1
9. Reproductibilitate
A se vedea pct. 10.1
10. Observaţii
10.1. Precizie
Un studiu colaborativ1) efectuat la nivel internaţional asupra furajelor amestecate a
ajuns la rezultatele pentru repetabilitate şi reproductibilitate indicate în
tabelul 1. Termenul repetabilitate (r) utilizat aici este definit ca fiind cea mai mare pondere nesemnificativă la nivelul de probabilitate de 95% pentru compararea
a două citiri ale aceleiaşi probe, în acelaşi laborator, în condiţii similare.
Termenul reproductibilitate (R) este definit similar pentru compararea în cazul a două laboratoare
diferite. In conformitate cu ISO 3534 - 1977, 2,352) şi cu Decizia Comisiei 89/61 O/CEE3), r şi R sunt daţi, de asemenea, în tabelul 1 drept coeficienţi de
variaţie.
Tabelul 1
Repetabilitatea (r) şi reproductibilitatea (R)
exprimate proporţional şi coeficienţii de variaţie corespondenţi (15
laboratoare)
|
Nivel
|
r
|
R
|
CVr*)
|
CVR
|
|
(µg/kg)
|
|
|
(%)
|
(%)
|
|
8 & 14
|
1,4
|
1,7
|
11
|
18
|
*) CV = coeficient de variaţie
10.2. Stabilizarea cloroformului (pct. 3.1)
Caracteristicile de absorbţie ale cartuşului de florisil pot fi schimbate dacă sunt utilizaţi alţi
stabilizatori decât etanolul. Trebuie să fie verificată conformitatea cu pct.
10.3, în cazul în care cloroformul descris nu este disponibil.
10.3. Acurateţe
Aplicarea corectă a metodei trebuie să fie verificată
prin efectuarea de măsurători repetate asupra materialelor de referinţă
certificate. In cazul în care acestea nu sunt disponibile, performanţa metodei
trebuie să fie verificată prin experimente repetate asupra unor probe blank
îmbunătăţite. Devierea valorii medii de la valoarea actuală, exprimată în
procente din valoarea actuală, nu trebuie să depăşească limitele de -20% până la
+10%.
1) Egmond, H.P. van,
Heisterkamp, S.H. şi Paulsch, W.E. (1991). Aditivi şi Contaminanţi
Alimentarii, 17-29.
2) ISO 3534-1977
3) JO nr. L 351,
2.12.1989, p. 39.
Figura 1*): Ansamblul coloană-cartuş
1. Faza mobila
2. Pompa
3. Valva de injecţie
4. Coloana garda
5. Coloana de analiza MCPL
6. Soluţie saturata de iod
7. Pompa reactiv
8. Piesa "T"
9. Baie controlata termostatic
10. Bobina spiralata de
reacţie
11. Detector de fluorescenta
12. Rcstrictor 13. Deşeuri
14. Dispozitiv de inregistrare
Figura 2*): Schema de curgere a sistemului LC de
derivatizare post-coloană cu iod
*) Figurile 1 şi 2 sunt reproduse în facsimil.
Figura 3*): Compensarea
aglomerării în răspunsul aflatoxinei B prin injectarea standardului de
referinţă (3.13.3) la intervale regulate de timp
C. Observaţii privind metodele A şi B
1. Degresare
Probele ce conţin mai mult de 5% grăsimi trebuie să fie
degresate cu eter de petrol (bp 40°C până la 60°C) după preparările indicate la
pct. 5.1.
In astfel de cazuri, rezultatele analitice trebuie să
fie exprimate în funcţie de masa probei nedegresate.
2. Reproductibilitatea
rezultatelor pentru metoda A
Reproductibilitatea
rezultatelor, de exemplu, variaţia dintre rezultatele obţinute în două sau mai
multe laboratoare privind aceeaşi probă, a fost estimată la:
±50% din valoarea medie pentru valorile medii ale
aflatoxinei B1 de la 10 şi până la 20 µg/kg;
±10 µg/kg din valoarea medie
pentru valori medii mai mari de 20 şi până la 50 µg/kg;
±20% din valoarea medie pentru valori medii peste 50
µg/kg.
*) Figura 3 este reprodusă în facsimil.
APENDICE*) la norma sanitară veterinară
Figura 1
Figura 2
*) Apendicele este reprodus în facsimil.
Figura 3