ORDIN
Nr. 484 din 18 octombrie 2002
pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind procedurile de diagnostic,
metodele de prelevare de probe si criteriile pentru evaluarea rezultatelor
testelor de laborator, pentru confirmarea si diagnosticul diferential al bolii
veziculoase a porcului
ACT EMIS DE: MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTATIEI SI PADURILOR
ACT PUBLICAT IN: MONITORUL OFICIAL NR. 878 din 5 decembrie 2002
In temeiul prevederilor art. 31 alin. 1 din Legea sanitara veterinara nr.
60/1974, republicata, cu modificarile si completarile ulterioare,
in baza Hotararii Guvernului nr. 362/2002 privind organizarea si
functionarea Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Padurilor, cu
modificarile si completarile ulterioare,
vazand Referatul de aprobare nr. 159.288 din 11 septembrie 2002, intocmit
de Agentia Nationala Sanitara Veterinara,
ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor emite urmatorul ordin:
Art. 1
Se aproba Norma sanitara veterinara privind procedurile de diagnostic,
metodele de prelevare de probe si criteriile pentru evaluarea rezultatelor
testelor de laborator, pentru confirmarea si diagnosticul diferential al bolii
veziculoase a porcului, prevazuta in anexa care face parte integranta din
prezentul ordin.
Art. 2
Directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti vor
duce la indeplinire prevederile prezentului ordin.
Art. 3
Agentia Nationala Sanitara Veterinara va controla modul de ducere la
indeplinire a prezentului ordin.
Art. 4
Prezentul ordin va fi publicat in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I,
si va intra in vigoare in termen de 15 zile de la data publicarii.
Ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor,
Ilie Sarbu
ANEXA 1
NORMA SANITARA VETERINARA
privind procedurile de diagnostic, metodele de prelevare de probe si criteriile
pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator, pentru confirmarea si
diagnosticul diferential al bolii veziculoase a porcului
Art. 1
(1) Autoritatea veterinara centrala a Romaniei trebuie sa se asigure ca la
baza confirmarii bolii veziculoase a porcului si a diagnosticului diferential
al acesteia de febra aftoasa se afla:
a) detectarea semnelor clinice de boala;
b) detectarea virusului, antigenului sau a genomului in probe de tesut
epitelial, lichid vezicular sau in fecale;
c) demonstrarea unui raspuns specific de anticorpi in probele de ser,
conform procedurilor;
d) metodele de prelevare de probe si criteriile pentru evaluarea
rezultatelor testelor de laborator stabilite in manualul prevazut in anexa.
(2) Laboratoarele de diagnostic la care se refera pct. 5 din anexa nr. 2 la
Norma sanitara veterinara privind masurile generale pentru controlul unor boli
ale animalelor si masurile specifice referitoare la boala veziculoasa a
porcului pot aplica modificari ale testelor de laborator la care se refera
manualul prevazut in anexa sau pot utiliza teste diferite, cu conditia ca
acestea sa demonstreze sensibilitate si specificitate egala cu a celor
nemodificate.
(3) Sensibilitatea si specificitatea acestor teste modificate sau diferite
trebuie sa fie evaluate in cadrul unor testari comparative periodice,
organizate de laboratorul de referinta comunitar pentru boala veziculoasa a
porcului.
Art. 2
(1) Autoritatea veterinara centrala a Romaniei poate adopta documente
legislative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme sanitare
veterinare pentru a asigura aplicarea si respectarea prevederilor acesteia.
(2) Autoritatea veterinara centrala a Romaniei va lua masurile
administrative sau penale adecvate pentru a pedepsi orice incalcare a
prevederilor prezentei norme sanitare veterinare.
(3) Autoritatea veterinara centrala a Romaniei poate modifica, completa sau
abroga total sau partial prevederile prezentei norme sanitare veterinare.
(4) Atunci cand autoritatea veterinara centrala a Romaniei adopta cele
mentionate la alineatele precedente, trebuie sa faca o referire expresa la
prezenta norma sanitara veterinara.
Art. 3
Anexa face parte integranta din prezenta norma sanitara veterinara.
ANEXA 1
la norma sanitara veterinara
MANUAL
de proceduri de diagnostic, metode de prelevare de probe si criterii pentru
evaluarea rezultatelor testelor de laborator pentru confirmarea si diagnosticul
diferential al bolii veziculoase a porcului
CAP. 1
Introducere, obiective si definitii
1. Prezentul manual de proceduri de diagnostic cuprinde metode de prelevare
de probe si criterii pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator pentru
confirmarea si diagnosticul diferential al bolii veziculoase a porcului:
a) principiile de baza si conditiile minime privind procedurile de
diagnostic, metodele de prelevare de probe si criteriile pentru evaluarea
rezultatelor testelor de laborator pentru un diagnostic corespunzator al bolii
veziculoase a porcului. O importanta deosebita se acorda diagnosticului
diferential cu febra aftoasa;
b) prevederile anexei nr. 2 la Norma sanitara veterinara privind masurile
generale pentru controlul unor boli ale animalelor si masurile specifice
referitoare la boala veziculoasa a porcului si, in special, pct. 4, 7 si 8 ale
anexei mentionate;
c) informatii folosite in primul rand de autoritatile responsabile pentru
controlul bolii veziculoase a porcului, accentul fiind pus pe principiile si
aplicatiile testelor de laborator si pe evaluarea rezultatelor acestora si nu
pe tehnici detaliate de laborator.
2. Conform prezentului manual, se intelege prin:
a) porc seropozitiv - orice porc al carui ser are un titru de anticorpi
egal sau mai mare decat serul 4 de referinta al bolii veziculoase a porcului la
care se refera cap. X;
b) reactant unic - orice porc singur seropozitiv dintr-o exploatatie, care
dezvolta un rezultat pozitiv la teste serologice pentru boala veziculoasa a
porcului, dar care nu are antecedente de contact cu virusul bolii veziculoase a
porcului si pentru care nu exista vreo dovada a raspandirii infectiei la porcii
de contact. Un porc seropozitiv este confirmat ca reactant unic daca sunt
indeplinite conditiile la care se refera cap. VIII lit. C;
c) porci de contact - porci care au contact direct sau au avut contact
direct, in ultimele 28 de zile, cu unul sau mai multi porci seropozitivi sau cu
unul sau mai multi porci suspecti de a fi infectati cu virusul bolii
veziculoase a porcului. Porcii de contact pot fi cazati in aceeasi boxa sau in
boxe adiacente, daca exista posibilitatea contactului porcilor intre boxe.
CAP. 2
Principii de baza pentru controlul porcilor care prezinta semne clinice ale
bolii veziculoase a porcului
1. Cand intr-o exploatatie este suspectata prezenta virusului bolii
veziculoase a porcului, un numar statistic semnificativ de porci trebuie sa fie
verificat de catre medicul veterinar oficial, cat mai curand posibil, pentru a
se detecta eventuale semne clinice ale bolii la care se refera prezenta anexa.
2. Cand porcii prezinta semne clinice pe baza carora se suspicioneaza boala
veziculoasa a porcului sau febra aftoasa, este efectuat, cat mai curand
posibil, diagnosticul diferential, prin mijloace adecvate de prelevare de probe
si investigatii de laborator, conform prevederilor cap. IV, VII si VIII.
CAP. 3
Proceduri generale pentru prelevare si transport de probe
1. Orice persoana care intra sau iese din exploatatii de porci, atunci cand
exista o suspiciune de boala veziculoasa a porcului, trebuie sa respecte
masurile de igiena cele mai stricte, necesare pentru a reduce riscul
contaminarii sau raspandirii cu virus.
2. Toti porcii de la care au fost prelevate probe trebuie sa fie marcati
individual in asa fel incat sa poata fi identificati pentru eventuale
reprelevari de probe. Se recomanda sa fie inregistrata localizarea fiecarui
porc din exploatatie de la care au fost prelevate probe, impreuna cu marca sa
individuala de identificare, in special daca au fost prelevate probe de la
porci suspecti.
3. Probele trebuie sa fie trimise la laborator, insotite de documentele
corespunzatoare, care vor include detalii ale antecedentelor clinice ale
porcilor de la care au fost prelevate probe si semnele clinice observate, daca
exista.
4. Atat timp cat orice afectiune veziculoasa la porci poate fi suspectata
ca fiind febra aftoasa, trebuie sa fie luate precautii speciale pentru
impachetarea in conditii de siguranta maxima a probelor suspecte. Aceste
precautii se refera la prevenirea spargerii sau fisurarii containerelor, precum
si la riscul contaminarii, fiind, de asemenea, important sa se asigure ca
probele sa ajunga la laborator intr-o stare satisfacatoare. Daca este pusa
gheata in interiorul unui astfel de pachet, trebuie sa fie prevenite scurgerile
de apa. Nici un container ce contine probe suspecte de contaminare cu virusul
bolii veziculoase a porcului nu trebuie sa fie deschis decat cand a ajuns in
laborator.
5. Probele suspecte de contaminare cu virusul bolii veziculoase a porcului
trebuie sa fie analizate numai intr-un laborator autorizat pentru a manipula
virusul febrei aftoase in scopul diagnosticului, conform legislatiei nationale
cu privire la controlul febrei aftoase, chiar daca suspiciunea de febra aftoasa
a fost deja eliminata.
6. Toate probele vor fi transportate la temperatura de 4 grade C, daca
durata transportului pana la laboratorul de destinatie este mai mica de 48 ore,
sau la o temperatura maxima de -20 grade C, daca durata transportului este mai mare.
7. Pentru probe destinate laboratorului de referinta comunitar singura
metoda de transport permisa este pe calea aerului via aeroportul din Londra
(Heathrow) sau aeroportul Gatwick. Inainte de imbarcarea probelor laboratorul
respectiv trebuie sa fie informat prin fax (+44-1483 23 26 21) sau prin e-mail
despre detaliile de zbor, data, timpul de sosire prevazut si numarul zborului,
pentru ca pachetul sa poata fi localizat la sosire. Pachetul trebuie sa fie
adresat Institutului pentru Sanatate Animala, Laboratorul Pirbright,
Laboratorul de referinta comunitar pentru boala veziculoasa a porcului, Ash
Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 ONF, Regatul Unit al Marii Britanii si
Irlandei de Nord, UK.
Urmatoarele informatii trebuie, de asemenea, sa fie incluse pe eticheta:
"Material patologic animal fara valoare comerciala. Perisabil. Fragil. A
fi ridicat din aeroport prin adresa. A nu fi deschis in afara
laboratorului". Ridicarea autorizata a pachetului la aeroport se
efectueaza de personalul de la laboratorul de referinta comunitar, in baza unei
autorizatii generale de import special emisa in acest scop de Ministerul
Agriculturii, Alimentatiei si Pescuitului din Regatul Unit al Marii Britanii si
Irlandei de Nord. Acesta este un acord permanent, o licenta separata care nu
este solicitata pentru orice import. Transportul ca bagaj de mana al
materialului vezicular suspect de catre personal neautorizat, in Regatul Unit
al Marii Britanii si Irlandei de Nord, precum si prin companiile de curierat
este interzis.
8. Transportul probelor la laboratoarele nationale trebuie sa fie conform
instructiunilor stabilite de autoritatea veterinara centrala a Romaniei.
CAP. 4
Proceduri de prelevare a probelor intr-o exploatatie cu porci suspecti
clinic
1. Cand intr-o exploatatie este suspectata prezenta virusului bolii
veziculoase a porcului si au fost observate semne clinice de boala, trebuie sa
fie prelevate probe corespunzatoare de la grupuri reprezentative de porci care
prezinta aceste semne, pentru a se confirma boala si a se efectua diagnosticul
diferential fata de febra aftoasa.
2. In aceste exploatatii probele de referinta pentru diagnostic sunt
epiteliul si lichidul vezicular recoltat de la vezicule proaspat rupte sau
nerupte si prelevate de la porci care prezinta semne tipice de boala si la care
pot fi detectate virusul bolii veziculoase a porcului, antigenele sau genomul
acestora. Se recomanda sa fie prelevate probe de la 5 sau 6 asemenea porci.
3. Chiar daca sunt disponibile tesut epitelial proaspat si lichid vezicular
in cantitate suficienta (1 g sau mai mult), trebuie sa fie prelevate si
urmatoarele probe:
a) probe de sange de la porci suspecti si porcii de contact, pentru testare
serologica;
b) probe de fecale de la porci suspecti, de pe podeaua boxei acestora si de
la boxele adiacente, pentru testare virusologica.
4. Probele trebuie sa fie prelevate si transportate conform urmatoarelor
proceduri:
a) pentru probe epiteliale si lichid vezicular:
1. trebuie sa fie prelevat, daca este posibil, cel putin 1 g de tesut
epitelial de la o vezicula rupta recent sau una nerupta. Se recomanda ca porcii
sa fie sedati inainte ca probele sa fie prelevate, pentru a se evita vatamarea
personalului si din motive de bunastare a porcilor;
2. daca transportul probelor catre laboratorul national este efectuat
imediat - in mai putin de 3 ore -, probele epiteliale pot fi transportate
uscate si pastrate refrigerate. Daca durata transportului depaseste 3 ore,
probele trebuie sa fie puse intr-un mediu de transport de volum mic, care
consta din cantitati egale de glicerol si 0,04 M fosfat-tampon sau alte
substante-tampon echivalente, astfel incat pH-ul sa fie mentinut in limita
optima pentru supravietuirea virusului febrei aftoase (pH de la 7,2 la 7,6).
Mediul de transport trebuie sa contina antibiotice pentru activitate
suplimentara antimicrobiana. Antibioticele corespunzatoare si concentratiile
acestora per ml, definitive, sunt: 1.000 U.I. penicilina, 100 U.I. neomicina
sulfat, 50 U.I. polimixina B sulfat, 100 U.I. micostatin;
3. daca poate fi prelevat lichid vezicular de la o vezicula nerupta, acesta
trebuie sa fie pastrat nediluat, intr-un container separat;
b) pentru probe de sange: pot fi prelevate probe de sange pentru teste
serologice sau virusologice. In general, acestea sunt prelevate pentru
detectarea anticorpilor si doar de la porci suspecti de a se fi insanatosit de
infectia clinica sau subclinica, in timp ce epiteliul, lichidul vezicular si
probele de fecale de la porci care prezinta semne clinice de boala sunt mult
mai adecvate pentru detectarea virusului decat probele de sange. Se recomanda
ca probele de sange integral sa fie prelevate folosindu-se seringi vacuumate
fara anticoagulant, iar acestea trebuie sa fie transportate fara a fi deschise;
c) pentru probe de fecale:
1. probe de fecale recoltate de pe podeaua cladirilor suspectate de a
contine sau de a fi continut porci infectati cu virusul bolii veziculoase a
porcului sau tampoane fecale si probe de fecale de la porci in viata suspecti
trebuie sa fie plasate in containere solide si rezistente la scurgeri;
2. containerele cu probe suspecte trebuie sa fie dezinfectate pe dinafara,
inainte de a fi transportate la laborator. Dezinfectantii corespunzatori sunt:
(i) hidroxidul de sodiu (dilutie 1:100);
(ii) formolul (dilutie 1:9 de solutie de formol care contine minimum 34%
formaldehida); si
(iii) hipocloritul de sodiu (cu 2% clor disponibil).
Acesti dezinfectanti trebuie sa fie manevrati cu grija, deoarece sunt
caustici.
CAP. 5
Proceduri de prelevare a probelor pentru supravegherea serologica a bolii
veziculoase a porcului
1. Pentru supravegherea exploatatiilor, atunci cand nu exista nici o
evidenta sau o suspiciune ca boala poate fi prezenta, se efectueaza prin
prelevare de probe serologice de rutina.
2. Pentru supravegherea la abator, la piata, la un centru de colectare sau
in locuri similare, se efectueaza prin prelevare de probe serologice de rutina.
3. Pentru supravegherea nediscriminatorie a porcilor primiti din state
membre ale Uniunii Europene, probele de sange pentru testarea serologica
trebuie sa fie prelevate de la porci din exploatatiile in care au fost
introdusi, conform prevederilor legale in vigoare.
4. Pentru supravegherea exploatatiilor situate in cadrul zonelor de
protectie sau de supraveghere care au fost stabilite ca urmare a confirmarii
focarelor de boala, conform pct. 7 si 8 din anexa nr. 2 la Norma sanitara
veterinara privind masurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor
si masurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, sau pentru
supravegherea exploatatiilor la care se refera art. 9 din Norma sanitara
veterinara privind masurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor
si masurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, probele de
sange trebuie sa fie prelevate de la porci, pentru testare serologica, conform
cu urmatoarea schema:
a) in cazul exploatatiilor pentru reproductie trebuie sa fie efectuata o
procedura aleatorie de prelevare de probe, in asa fel incat sa se detecteze o
prevalenta de 5% de seroconversie cu 95% fidelitate;
b) in cazul exploatatiilor care contin numai porci pentru ingrasare,
procedura de prelevare de probe trebuie sa asigure ca numarul total de probe
prelevate sa fie cel putin egal cu numarul necesar pentru a se detecta o
prevalenta de 5% de seroconversie cu 95% fidelitate. In orice caz probele
trebuie sa fie prelevate, pe cat este posibil, de la cat mai multe boxe selectate
aleatoriu;
c) in cazul exploatatiilor mixte, de crestere si reproductie, trebuie sa
fie prelevate probe de la fiecare grup de porci care este cazat in cladiri
separate, in asa fel incat sa se detecteze o prevalenta de 5% de seroconversie
cu 95% fidelitate.
CAP. 6
Actiuni ulterioare si proceduri de reprelevare de probe in cazul detectarii
de porci seropozitivi
1. Cand intr-o exploatatie este detectat un singur porc seropozitiv in urma
supravegherii la care se refera cap. V pct. 1 sau 4, autoritatea veterinara
locala trebuie:
a) sa aplice masurile la care se refera art. 4 din Norma sanitara
veterinara privind masurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor
si masurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului;
b) sa efectueze un control in exploatatie conform prevederilor cap. II pct.
1;
c) sa preleveze probe de sange pentru testarea serologica de la:
- porcul suspect;
- porcii de contact care sunt cazati in aceeasi boxa sau in boxe adiacente
cu porcul suspect. Trebuie sa fie prelevate probe de la acesti porci in asa fel
incat sa se detecteze o prevalenta de 50% de seroconversie cu 95% fidelitate
pentru fiecare boxa.
2. Autoritatea veterinara centrala a Romaniei poate decide sa ridice
masurile la care se refera pct. 1 lit. a) al prezentului capitol, daca:
a) ancheta epizootologica efectuata conform prevederilor art. 8 din Norma
sanitara veterinara privind masurile generale pentru controlul unor boli ale
animalelor si masurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului
arata ca boala veziculoasa a porcului nu a fost introdusa in exploatatie;
b) nici un semn clinic de boala veziculoasa a porcului nu a fost detectat
in exploatatie; si
c) exploatatia nu este situata intr-o zona de supraveghere sau de
restrictie, stabilita ca urmare a unui focar de boala confirmat, nu este supusa
altor restrictii aplicate cu privire la un focar de boala confirmat
si cu conditia ca:
- nici un porc din exploatatie sa nu faca obiectul comertului Romaniei cu
statele membre ale Uniunii Europene; si
- porci de la exploatatia respectiva sa fie livrati doar la un abator
pentru a fi taiati imediat sau la alta exploatatie din care nici un porc nu
face obiectul comertului Romaniei cu statele membre ale Uniunii Europene, pana
cand rezultatele controalelor ulterioare si ale testelor serologice arata ca
boala veziculoasa a porcului poate fi eliminata definitiv.
3. Daca controalele si testele serologice efectuate conform pct. 1 lit. b)
si c) ale prezentului capitol:
a) au rezultate negative sau numai un porc pozitiv este in prealabil
confirmat pozitiv (reactant unic), boala veziculoasa a porcului poate fi
infirmata. Masurile la care se refera pct. 1 lit. a) vor fi ridicate, cu
exceptia cazului cand exploatatia se afla intr-o zona de protectie sau de
supraveghere stabilita in jurul unui focar de boala, unde masurile de eradicare
a bolii trebuie sa fie in vigoare, conform pct. 7 sau 8 din anexa nr. 2 la
Norma sanitara veterinara privind masurile generale pentru controlul unor boli
ale animalelor si masurile specifice referitoare la boala veziculoasa a
porcului;
b) arata faptul ca este prezent mai mult de un porc seropozitiv in
exploatatie, boala veziculoasa a porcului trebuie sa fie confirmata sau, daca
conditiile stabilite la pct. 4 din anexa nr. 2 la Norma sanitara veterinara
privind masurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor si masurile
specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului nu sunt indeplinite
pentru a confirma prezenta acestei boli, trebuie sa fie prelevate din
exploatatie ulterior probe conform procedurilor de prelevare de probe la care
se refera pct. 4 al prezentului capitol.
4. In cazul in care este detectat mai mult de un porc seropozitiv intr-o
exploatatie, ca urmare a prelevarii de probe si a testelor serologice la care
se refera cap. V pct. 1 si 3 sau pct. 2 al prezentei anexe, iar conditiile
stabilite la pct. 4 din anexa nr. 2 la Norma sanitara veterinara privind
masurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor si masurile
specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului nu sunt indeplinite,
pentru a se confirma boala veziculoasa a porcului autoritatea veterinara
centrala a Romaniei trebuie sa dispuna urmatoarele:
a) aplicarea sau continuarea aplicarii prevederilor art. 4 din Norma
sanitara veterinara privind masurile generale pentru controlul unor boli ale
animalelor si masurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului;
b) efectuarea unui control in acea exploatatie, conform prevederilor cap.
II pct. 1;
c) prelevarea ulterior de probe de sange pentru testarea serologica de la
porci seropozitivi si de la porcii de contact, conform pct. 1 lit. c) al
prezentului capitol;
d) prelevarea probelor de sange pentru testarea serologica de la porcii din
alte cladiri ale exploatatiei, conform procedurii cap. V pct. 2;
e) prelevarea unui numar suficient de probe de fecale pentru testele
virusologice:
(i) de la porci seropozitivi;
(ii) de pe podeaua boxelor care contin porci seropozitivi si a boxelor
adiacente;
(iii) din boxe selectate aleatoriu din alte cladiri ale exploatatiei -
probele de fecale prelevate trebuie sa fie examinate cat mai curand posibil,
conform prevederilor pct. (i) si (ii).
Daca aceste probe sunt negative, dar rezultatele testelor serologice
creeaza suspiciunea ca virusul bolii veziculoase a porcului poate fi raspandit
la celelalte cladiri, trebuie prelevate probe de fecale conform prevederilor
pct. (iii), pentru a fi examinate; daca in urma acestor controale si teste
ulterioare conditiile stabilite la pct. 4 din anexa nr. 2 la Norma sanitara
veterinara privind masurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor
si masurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului nu sunt
indeplinite, pentru a se confirma prezenta bolii veziculoase a porcului, porcii
seropozitivi vor fi ucisi sau taiati, conform prevederilor pct. 4 lit. d) din
anexa nr. 2 la Norma sanitara veterinara privind masurile generale pentru
controlul unor boli ale animalelor si masurile specifice referitoare la boala
veziculoasa a porcului. Daca ulterior au fost gasiti mai multi porci
seropozitivi, pe langa ceilalti deja gasiti seropozitivi ca urmare a prelevarii
de probe anticipate, prevederile si procedurile stabilite la lit. a), b), c),
d) si e) ale prezentului punct vor fi aplicate ulterior mutatis mutandis.
5. Fara a aduce atingere masurilor prevazute la art. 9 din Norma sanitara
veterinara privind masurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor
si masurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, cand unul
sau mai multi porci sunt detectati pozitiv, ca urmare a activitatii de
supraveghere la care se refera cap. V pct. 2 sau 3, autoritatea veterinara
centrala a Romaniei va dispune:
a) efectuarea controalelor ulterioare corespunzatoare, cand este necesar,
care includ si prelevarea de probe, pentru a se confirma sau a se infirma boala
veziculoasa a porcului in locul unde acesti porci au fost detectati, luand in
considerare situatia epizootologica locala;
b) aplicarea in exploatatia de origine a acestor porci a masurilor
prevazute la art. 4 din Norma sanitara veterinara privind masurile generale
pentru controlul unor boli ale animalelor si masurile specifice referitoare la
boala veziculoasa a porcului;
c) efectuarea unui control in exploatatia de origine a acestor porci,
conform prevederilor cap. II pct. 1; si
d) prelevarea probelor de sange de la porcii din exploatatia de origine
pentru testarea serologica a porcilor seropozitivi, conform prevederilor cap. V
pct. 2.
6. Autoritatea veterinara centrala a Romaniei poate decide sa ridice
masurile prevazute la pct. 5 lit. b) al prezentului capitol, daca:
a) ancheta epizootologica, efectuata conform prevederilor art. 4 si 8 din
Norma sanitara veterinara privind masurile generale pentru controlul unor boli
ale animalelor si masurile specifice referitoare la boala veziculoasa a
porcului, arata ca boala veziculoasa a porcului nu a fost introdusa in
exploatatie;
b) nici un semn clinic de boala veziculoasa a porcului nu a fost detectat
in exploatatie;
c) exploatatia nu este situata intr-o zona de supraveghere sau de
restrictie stabilita ca urmare a confirmarii unui focar de boala si nu este
supusa altor restrictii aplicate pentru a se confirma un focar de boala, cu
conditia ca:
(i) nici un porc din exploatatie sa nu faca obiectul comertului Romaniei cu
statele membre ale Uniunii Europene; si
(ii) porcii din exploatatie sa fie destinati doar taierii imediate, la un
abator sau la alta exploatatie de la care nici un porc nu face obiectul
comertului Romaniei cu statele membre ale Uniunii Europene, pana cand
rezultatele controalelor ulterioare si ale testelor serologice efectuate in
locul unde au fost detectati porci seropozitivi si in exploatatia de origine
arata ca boala veziculoasa a porcului poate fi cu certitudine infirmata.
CAP. 7
Principii si aplicatii ale testelor virusologice si evaluarea rezultatelor
lor
A. Detectarea antigenului viral
1. Un test sandwich ELISA indirect inlocuieste testul de fixare a
complementului, ca metoda selectata pentru detectarea antigenului viral al
bolii veziculoase a porcului. Testul este acelasi ca cel utilizat pentru
diagnosticul febrei aftoase. Testele pentru cele doua boli trebuie sa fie
efectuate in acelasi timp, cu exceptia cazului in care febra aftoasa a fost
deja infirmata. Se recomanda in special probe de epiteliu sau de lichid din
leziunile veziculoase, in care atat virusul bolii veziculoase a porcului, cat
si cel al febrei aftoase pot fi prezente la titruri inalte la porcii cu
infectie acuta si care sunt detectati in cateva ore*1).
Randuri duplicat din placile ELISA multigodeu sunt acoperite cu antiser de
iepure contra virusului bolii veziculoase a porcului si pentru fiecare dintre
cele 7 serotipuri ale virusului febrei aftoase. Acestea sunt seruri de blocare.
Suspensii ale probei de testat se adauga la fiecare godeu al celor doua
randuri. Controale pozitive sunt de asemenea incluse. Ser de detectie omolog de
cobai este adaugat in godeurile din randurile respective, in etapa urmatoare
ori apoi, de ser de iepure anticobai conjugat cu o enzima, cum ar fi peroxidaza
de hrean. Se realizeaza spalarea intensiva intre fiecare etapa, pentru a se
indeparta reagentii nelegati.
O reactie pozitiva este indicata daca exista o reactie de culoare la
adaugarea cromogenului si a substratului. Reactiile intens pozitive pot fi
evidentiate cu ochiul liber, dar rezultate pot sa fie citite, de asemenea,
spectrofotometric, caz in care o citire a absorbantei de 0,1 deasupra limitei
de fond indica o reactie pozitiva.
------------
*1) Rezultatele pozitive ELISA sunt asociate cu prezenta a cel putin 10 5
TCID50 - doze infectioase de cultura de tesut - de virus in probe.
2. Pot fi folosite sisteme alternative bazate pe anticorpi monoclonali,
sisteme care selecteaza anticorpi monoclonali precum anticorpii de blocare si
anticorpii peroxidazo-conjugati monoclonali ca anticorpi de detectie, pentru
detectarea antigenului bolii veziculoase a porcului si pentru diagnosticul
diferential de febra aftoasa in probele de epiteliu, lichid vezicular sau
cultura de tesut infectat.
3. Poate fi folosit un sistem bazat pe anticorpi monoclonali pentru a se
studia variatia antigenica dintre tulpinile virusului bolii veziculoase a
porcului. Antigenele virale crescute in tesutul-cultura sunt blocate de un
antiser hiperimun de iepure contra bolii veziculoase a porcului, adsorbit de
faza solida. Secvente corespunzatoare de anticorpi monoclonali reactioneaza si
legarea anticorpilor monoclonali la tulpinile salbatice este comparata cu
legarea anticorpilor monoclonali la tulpinile parentale. O legatura similara
indica prezenta epitopilor, impartiti intre tulpinile parentale si cele
salbatice.
B. Izolarea si cresterea virusului
1. Ca rutina, suspensii filtrate de probe de epiteliu, lichid vezicular sau
fecale suspecte de a contine virusul bolii veziculoase a porcului trebuie sa
fie inoculate pe culturi de celule sensibile. Daca cantitatea si calitatea
probelor prelevate din leziuni si supuse examinarii sunt insuficiente pentru
examinarea imediata prin ELISA, este necesara cresterea de virus in cultura de
tesut pentru a amplifica antigenul viral.
2. Pentru a izola si a creste virusul, suspensia epiteliala filtrata este
inoculata pe culturi monostrat de celule IB-RS-2. Trebuie sa fie utilizate doua
dilutii de suspensie epiteliala, una de concentratie mare (1/500) si una de
concentratie mica (1/10) pentru a evita interferenta cu virusul crescut pe
interferon, a carui eliberare va interfera cu virusul bolii veziculoase a
porcului. Pentru izolarea virusului sunt adaugate numai antibiotice, in vederea
mentinerii mediului. Pentru diagnosticul diferential fata de febra aftoasa
trebuie, de asemenea, sa fie inoculate celule tiroidiene primare de bovine sau
celule renale de pui de hamster (BHK-21).
3. Daca se dezvolta un efect citopatic, fluidul supernatant trebuie sa fie
prelevat din culturile pozitive, atunci cand efectul este complet, si utilizat
in testul ELISA pentru identificarea virusului. Culturile negative trebuie sa
fie inoculate pe culturi de tesut proaspat de 48 sau 72 de ore, iar acest pasaj
orb trebuie examinat dupa 72 de ore. In absenta efectului citopatic, dupa un
pasaj orb ulterior proba poate fi declarata negativa pentru prezenta virusului
viu.
4. Suspensii de probe de fecale pot fi procesate ca in descrierea de la
pct. 1. Deoarece in general exista mai putin virus in fecale decat in epiteliu,
este esential ca in absenta unui efect citopatic la primele doua pasaje sa fie
inclus un al treilea pasaj orb.
5. Inocularea simultana a unei linii celulare porcine si a unuia dintre
sistemele de cultura de tesut mentionat mai sus - de preferat celule tiroidiene
bovine primare - este un ghid util pentru a determina daca probele veziculare
contin virusul bolii veziculoase a porcului sau virusul febrei aftoase care, ca
si in primul sistem, se va dezvolta numai in celule de origine porcina. Totusi
culturile de virus al febrei aftoase, cu o istorie indelungata de transmitere
intre porci, pot, de asemenea, sa se dezvolte, de preferinta, in sistemele de
culturi celulare de origine porcina.
C. Reactia de polimerizare in lant pentru depistarea genomului (PCR)
1. Metode de recunoastere a acidului nucleic pot fi utilizate pentru a
detecta genomul viral al bolii veziculoase a porcului in materialul clinic si
care foloseste tehnica PCR pentru a stabili legaturile dintre tulpinile de
virus al bolii veziculoase a porcului, prin determinarea secventei de
nucleotide a unei parti de genom. Tehnici care folosesc PCR au fost perfectate
pentru a se imbunatati sensibilitatea diagnosticului. Au fost descrise
proceduri de PCR-RT usor diferite, folosind primeri care corespund unor regiuni
intens conservate din genele 1C si 1D ale genomului viral.
2. Tehnica PCR este rapida - rezultatele sunt de obicei disponibile in 24
de ore - si se detecteaza toate genotipurile de virus al bolii veziculoase a
porcului, fiind suficient de sensibila pentru a se utiliza la prelevarea
probelor de la cazurile suspecte clinic de boala.
3. Atunci cand este suspectata infectia subclinica sau atunci cand probele
sunt colectate dupa disparitia bolii clinice ori cand este necesara procesarea
probelor de fecale, tehnicile PCR-RT perfectionate, asemanatoare PCR-RT
secventiale, PCR-imun, PCR-ELISA si metode mai elaborate de extractie a ARN,
care produc un sistem de detectare cel putin la fel de sensibil, dar
considerabil mult mai rapid decat pasajul multiplu pe cultura de tesut.
4. Prin secventarea a aproximativ 200 de nucleotide din cadrul genei 1D
care codifica proteina structurala majora VP1 este posibila gruparea tulpinilor
virusului bolii veziculoase a porcului, conform omologiei lor de secventa,
precum si a tulpinilor inrudite epidemiologic si care provoaca boli in regiuni
diferite sau la perioade diferite.
D. Evaluarea rezultatelor testelor virusologice
1. Detectarea de antigene sau de genom al virusului bolii veziculoase a
porcului prin metodele ELISA sau PCR are aceeasi valoare de diagnostic ca si
izolarea virusului.
2. Totusi izolarea virusului trebuie sa fie considerata ca test de
referinta si trebuie sa fie utilizata ca test de confirmare, daca este necesar,
in special daca un rezultat pozitiv ELISA sau PCR nu este asociat cu:
a) detectarea de semne clinice ale bolii;
b) detectarea de porci seropozitivi; sau
c) o legatura epizootologica directa cu un focar confirmat.
CAP. 8
Principii si aplicatii ale testelor serologice si evaluarea rezultatelor
acestora
A. Test de neutralizare a virusului (VN)
1. Microtestul cantitativ de virus neutralizare (VN) pentru detectarea
anticorpilor indusi de virusul bolii veziculoase a porcului este efectuat pe
celule IB-RS-2 sau pe un sistem de celule echivalent, in placi de microtitrare
cu fundul lat din categoria cu cultura de tesut.
2. Virusul este crescut in monostraturi de celule IB-RS-2 si depozitat fie
la -20 grade C dupa adaugarea de glycerol 50%, fie la -70 grade C fara
glycerol. Serurile sunt inactivate inaintea testarii la 56 grade C timp de 30
de minute.
B. ELISA
1. Testul ELISA pentru detectarea anticorpilor este un test competitiv
bazat pe anticorpi monoclonali. Daca proba de ser contine anticorpi ai
virusului bolii veziculoase a porcului, legatura unor anticorpi monoclonali
selectati, conjugati cu peroxidaza, cu antigenul virusului bolii veziculoase a
porcului va fi inhibata. In acest test ELISA antigenul viral al bolii
veziculoase a porcului este blocat in faza solida, folosindu-se anticorpi
monoclonali, apoi probele de ser sunt incubate in dilutie corespunzatoare,
urmata de adaugarea anticorpului monoclonal conjugat cu peroxidaza. Ulterior
inhibitia legaturii anticorpului monoclonal cu antigenul bolii veziculoase a porcului
este masurata prin intermediul unui substrat si al unui cromogen.
2. Un test ELISA indirect de blocare, care foloseste anticorpi monoclonali
izotipi specifici pentru a se detecta IgG sau IgM specifica porcului contra
virusului bolii veziculoase a porcului, este util pentru evaluarea timpului de
la infectia porcilor sau de la contaminarea spatiilor infectate. In cazul
acestui test ELISA izotipul specific antigenului viral este blocat in faza
solida, folosindu-se un anticorp de captare a antigenului. Daca proba de ser
contine anticorpi pentru virusul bolii veziculoase a porcului, acestia sunt
detectati folosindu-se o IgG antiporc sau o IgM antiporc monoclonal conjugat cu
peroxidaza. Ulterior aceasta legatura este masurata prin intermediul unui substrat
si al unui cromogen.
Testul ELISA izotip specific poate fi util, de asemenea, pentru deosebirea
reactantului unic de adevaratii porci pozitivi, asa cum prevede lit. C.
C. Aplicarea testelor serologice si evaluarea rezultatelor
1. Testul de VN si testul ELISA sunt teste serologice recomandate. Cap. X
enumera serurile de referinta care sunt disponibile la laboratorul de referinta
comunitar, pentru a standardiza testele serologice efectuate in Comunitatea
Europeana. Testul de VN trebuie sa fie considerat ca test de referinta, dar are
dezavantajul ca se finalizeaza in 2 sau 3 zile si necesita facilitati pentru
culturi celulare. Testul ELISA este mult mai rapid si poate fi mult mai usor
standardizat. Testul ELISA de competitie cu anticorpi monoclonali este cel mai
fiabil. Testul ELISA descris pana in prezent, utilizand anticorpi ai bolii
veziculoase a porcului, este recomandat ca test de screening pentru un numar
mare de probe. Totusi testul de VN trebuie sa fie utilizat ca test de
confirmare, daca este necesar, in special dupa prima detectare de probe
pozitive intr-o exploatatie. Porcii pozitivi la testul ELISA, dar negativi la
testul de VN, pot fi omisi.
2. Prezenta unui reactant unic*2) poate fi suspectata atunci cand este
detectat un singur porc seropozitiv si cand sunt indeplinite urmatoarele
criterii:
a) nu exista semne clinice de boala in exploatatie;
b) nu exista un istoric relevant al bolii clinice in exploatatie;
c) nu exista antecedente de contact cu un focar de boala.
------------
*2) O proportie mica de reactant unic poate fi detectata prin orice test
serologic curent utilizat pentru boala veziculoasa a porcului. Factorii
responsabili pentru reactantii unici sunt necunoscuti.
Reactivitate serologica incrucisata cu virusul bolii veziculoase a porcului
poate aparea datorita infectarii cu un alt picornavirus inca neidentificat sau
poate fi datorat altor factori nespecifici prezenti in ser.
3. Un porc este confirmat drept reactant unic atunci cand:
a) dupa testare nu sunt identificati alti porci seropozitivi;
b) prelevarea de probe efectuata la porcii de contact dupa prima detectare
a reactantului unic nu indica seroconversie;
c) titrul de anticorpi pentru o prelevare de probe repetata ramane constant
sau deviaza.
4. Totusi urmatoarele criterii si principii suplimentare trebuie, de
asemenea, sa fie luate in considerare pentru confirmarea unui reactant unic:
a) reactantii unici apar cu o prevalenta de aproximativ 1 per 1.000 de
porci;
b) serurile de la reactantii unici au, in general, urmatorul profil: titrul
anticorpilor scazut la testul de VN, linia de granita pozitiva la testul ELISA
de competitie pe baza de anticorpi monoclonali, nici o IgM si nici o IgG la
testul ELISA izotip specific pentru boala veziculoasa a porcului*3).
------------
*3) IgG specifica singura sau atat IgG, cat si IgM sunt de obicei detectate
in probe de ser de la porcii infectati cu virusul bolii veziculoase a porcului,
intrucat serul de la reactantii unici contine in general numai IgM. IgG nu va
fi detectata in probele de ser de la porcii infectati cu virusul bolii
veziculoase a porcului intr-o perioada de pana la 10 sau 14 zile. Totusi IgG
specifica va fi detectata in a doua proba de sange. Porcii infectati recent nu pot
fi deosebiti in mod sigur de reactantii unici inainte ca raspunsul imun al
acestora sa se modifice de la producerea de IgM la cea de IgG. A se vedea, de
asemenea, si nota de subsol 4).
CAP. 9
Semne clinice si particularitati ale bolii veziculoase a porcului
1. Boala veziculoasa a porcului este o boala contagioasa a porcilor,
produsa de un enterovirus din familia Picornaviridae care poate evolua sub
forma veziculoasa subclinica, usoara sau severa, ce depinde de tulpina de virus
implicata, de calea si doza infectanta, precum si de conditiile de crestere in
care au fost tinuti porcii. Factorii de stres suplimentari, precum transportul,
aglomerarea cu alti porci si temperaturile extreme, pot, de asemenea,
predispune la dezvoltarea semnelor clinice.
2. Boala se caracterizeaza printr-o febra usoara si aparitia de vezicule pe
bureletul coronarian, pe protuberantele calcaielor, pe pielea membrelor si mai
putin frecvent pe rat, buze, limba si mameloane. Rata morbiditatii poate fi
pana la 100%, iar mortalitatea este foarte scazuta sau nula.
3. Infectia se poate dezvolta sub o forma inaparenta sau usoara care
prezinta doar o afectare tranzitorie in starea generala a porcilor si care
conduce la dezvoltarea de anticorpi ce neutralizeaza virusul in cateva zile*4).
Din cauza naturii subclinice sau usoare a bolii, aceasta este deseori
suspectata prima, ca urmare a testelor serologice pentru supravegherea bolii
sau pentru certificarea exportului. Focarele europene recente de boala
veziculoasa a porcului au fost caracterizate prin semne clinice mai putin
severe sau chiar fara semne clinice, diagnosticul fiind frecvent dependent de
testele serologice. Totusi semnele clinice ale bolii veziculoase a porcului nu
se pot deosebi de cele ale febrei aftoase. Orice forma veziculara trebuie sa
fie tratata initial ca suspecta de febra aftoasa, iar diagnosticul diferential
trebuie sa fie efectuat cat mai curand posibil.
------------
*4) IgM specifica poate fi, de obicei, detectata in sange de la 2 la 3 zile
dupa infectie si dispare dupa 30 pana la 50 de zile. IgG specifica poate fi, de
obicei, detectata in sange de la 10 la 14 zile dupa infectie si persista cel
putin pentru cativa ani. Ig izotip poate fi determinata prin intermediul
testului ELISA descris la cap. VIII lit. B pct. 2.
4. Perioada de incubatie a bolii veziculoase a porcului la porcii
individuali este, de obicei, intre 2 si 7 zile, dupa care urmeaza febra
pasagera de pana la 41 grade C, dar semnele clinice pot deveni evidente in
exploatatie dupa o perioada mai lunga. Veziculele se dezvolta apoi pe bureletul
coronarian, in special la jonctiunea cu onglonul. Acestea pot afecta intregul
burelet coronarian si provoaca pierderea copitei. Mult mai rar veziculele pot,
de asemenea, sa apara pe rat, in special pe suprafata dorsala, pe buze, pe
limba si pe mameloane, iar eroziuni de dimensiuni mici pot fi observate pe
genunchi. Porcii afectati pot schiopata si pot refuza hrana. Porcii mai tineri
sunt mult mai sever afectati, desi mortalitatea datorata bolii veziculoase a
porcului este foarte rara, in contrast cu febra aftoasa, la efectivul tanar.
5. Au fost raportate semne nervoase, dar acestea sunt neobisnuite. Avortul
nu este o caracteristica tipica a bolii veziculoase a porcului. Insuficienta
cardiaca datorata miocarditei multifocale poate fi o caracteristica a febrei
aftoase si a encefalomiocarditei, in special la purceii tineri, dar nu apare in
boala veziculoasa a porcului.
6. Vindecarea este de obicei completa in 2 sau 3 saptamani, singura evidenta
a infectiei fiind o linie orizontala, intunecata pe copita, acolo unde
cresterea onglonului a fost intrerupta temporar.
7. Porcii afectati pot excreta virusul prin orificiile nazale si pe gura si
prin fecale, cu 48 de ore inainte de aparitia semnelor clinice. Cea mai mare
cantitate de virus este eliminata in primele 7 zile dupa infectie, iar excretia
de virus prin orificiile nazale si pe gura se opreste, in mod normal, dupa doua
saptamani. Virusul poate fi izolat din fecale pana la 20 de zile dupa infectie,
desi a fost raportata prezenta sa pana la 3 luni. Acesta poate persista pentru
o perioada considerabila in tesutul necrotic asociat cu vezicule rupte si in
fecale.
CAP. 10
Seruri de referinta pentru boala veziculoasa a porcului
________________________________________________________________________________
Ser de Origine Comentarii*5)
referinta
________________________________________________________________________________
1 Ser normal de porc Ser*5) de control negativ
________________________________________________________________________________
2 Ser colectat la 21 de zile dupa Ser de control intens pozitiv
infectie (dpi) de la porci
infectati cu tulpina virusului
bolii veziculoase a porcului
UKG 27/72
________________________________________________________________________________
3 Dilutie A 1:10 in NPS a unui Un ser slab pozitiv prelevat de la
un
ser colectat dupa 5 dpi de la porc imediat dupa infectie cu o
un porc infectat cu tulpina tulpina de virus europeana recenta a
bolii veziculoase a porcului bolii veziculoase a porcului. Serul
a
8/94/Italia fost diluat pentru a da un rezultat
slab pozitiv la testul ELISA si la
testul de VN
________________________________________________________________________________
4 Dilutie de A 1:40 a unui ser Un ser slab pozitiv care defineste
colectat la 21 dpi de la un nivelul cel mai scazut de anticorpi
porc infectat cu tulpina pe care laboratoarele nationale de
virusului bolii veziculoase a referinta ale Uniunii Europene ar
porcului UKG 27/72 trebui sa il evidentieze ca fiind
consistent pozitiv prin metoda ELISA
si prin metoda de neutralizare a
virusului. Echivalent pentru ser
RS 01-04-94*6)
________________________________________________________________________________
5 Ser colectat la 4 dpi de la un Un ser slab pozitiv prelevat de la
un
porc infectat cu tulpina porc imediat dupa infectie
virusului bolii veziculoase a
porcului UKG 27/72
________________________________________________________________________________
6 Ser colectat la 5 dpi de la un Un ser slab pozitiv prelevat de la
un
porc infectat cu tulpina porc imediat dupa infectie
virusului bolii veziculoase a
porcului UKG 27/72
________________________________________________________________________________
*5) Comentarii cu privire la testarea porcilor individuali. Pentru
supravegherea serologica sensibilitatea testului folosit trebuie sa fie luata
in considerare.
*6) De exemplu, un ser cu un titru suficient mai crescut decat limita la
care acesta este evaluat ca fiind intotdeauna pozitiv prin metoda ELISA si prin
testul de VN la testarea repetata.