ORDIN   Nr. 555/1020/1 din  2 decembrie 2002

privind aprobarea Metodei de analiza de referinta pentru detectarea laptelui de vaca si a cazeinatilor din lapte de vaca in branzeturile produse din lapte de oaie, lapte de capra sau lapte de bivolita ori din amestecuri de lapte de oaie, capra si bivolita

ACT EMIS DE: MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTATIEI SI PADURILOR

              Nr. 555 din 2 decembrie 2002
              MINISTERUL SANATATII SI FAMILIEI
              Nr. 1.020 din 17 decembrie 2002
              AUTORITATEA NATIONALA PENTRU PROTECTIA CONSUMATORILOR
              Nr. 1 din 16 ianuarie 2003
ACT PUBLICAT IN: MONITORUL OFICIAL  NR. 236 din  7 aprilie 2003

    Vazand Referatul de aprobare nr. 132.534 din 5 noiembrie 2002 al Directiei generale de elaborare si armonizare a politicilor, strategiilor si programelor,
    avand in vedere prevederile art. 38 alin. (9) lit. b) din Ordonanta de urgenta a Guvernului nr. 97/2001 privind reglementarea productiei, circulatiei si comercializarii alimentelor, aprobata cu modificari prin Legea nr. 57/2002,
    in temeiul Hotararii Guvernului nr. 362/2002 privind organizarea si functionarea Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Padurilor, cu modificarile si completarile ulterioare, al Hotararii Guvernului nr. 22/2001 privind organizarea si functionarea Ministerului Sanatatii si Familiei, cu modificarile si completarile ulterioare, si al Hotararii Guvernului nr. 166/2001 privind organizarea si functionarea Autoritatii Nationale pentru Protectia Consumatorilor, cu modificarile ulterioare,

    ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor, ministrul sanatatii si familiei si presedintele Autoritatii Nationale pentru Protectia Consumatorilor emit urmatorul ordin:

    Art. 1
    Se aproba Metoda de analiza de referinta pentru detectarea laptelui de vaca si a cazeinatilor din lapte de vaca in branzeturile produse din lapte de oaie, lapte de capra sau lapte de bivolita ori din amestecuri de lapte de oaie, capra si bivolita, prevazuta in anexa care face parte integranta din prezentul ordin.
    Art. 2
    Metoda de analiza de referinta se aplica in laboratoarele oficiale ale autoritatilor competente pentru executarea controlului oficial al alimentelor, stabilite prin art. 38 din Ordonanta de urgenta a Guvernului nr. 97/2001 privind reglementarea productiei, circulatiei si comercializarii alimentelor, aprobata cu modificari prin Legea nr. 57/2002.
    Art. 3
    Agentii economici care produc si/sau comercializeaza branzeturi ale caror denumire si compozitie, mentionate pe eticheta sau in declaratia de conformitate cu specificatia tehnica, nu corespund cu rezultatele analizelor de laborator se sanctioneaza de catre autoritatile mentionate in art. 2, conform art. 41 - 43 din Ordonanta de urgenta a Guvernului nr. 97/2001, aprobata cu modificari prin Legea nr. 57/2002.
    Art. 4
    Ministerul Agriculturii, Alimentatiei si Padurilor, Ministerul Sanatatii si Familiei, Autoritatea Nationala pentru Protectia Consumatorilor, agentii economici care desfasoara activitati de producere si comercializare a branzeturilor vor duce la indeplinire prevederile prezentului ordin.
    Art. 5
    Prezentul ordin se publica in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, si intra in vigoare la 1 ianuarie 2004.

              Ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor,
              Ilie Sarbu

              p. Ministrul sanatatii si familiei,
              Radu Deac,
              secretar de stat

              Presedintele Autoritatii Nationale
              pentru Protectia Consumatorilor,
              Rovana Plumb,
              secretar de stat

    ANEXA 1

                       METODA DE ANALIZA DE REFERINTA
pentru detectarea laptelui de vaca si a cazeinatilor din lapte de vaca in branzeturile produse din lapte de oaie, lapte de capra sau lapte de bivolita ori din amestecuri de lapte de oaie, capra si bivolita

    I. Generalitati
    1.1. Metoda de analiza de referinta se utilizeaza in vederea garantarii faptului ca branza care trebuie produsa exclusiv din lapte de oaie, lapte de capra sau lapte de bivolita ori dintr-un amestec de lapte de oaie, capra si bivolita nu contine de fapt cazeina din lapte de vaca.
    1.2. Se considera ca este prezenta cazeina din lapte de vaca daca continutul aparent de cazeina din lapte de vaca al probei analizate este mai mare sau egal cu continutul probei de referinta descrise, care contine 1% lapte de vaca.
    2. Metodele de rutina folosite pentru detectarea cazeinei din lapte de vaca in branzeturile mentionate la pct. 1 se utilizeaza in urmatoarele conditii:
    a) limita de detectare trebuie sa fie de 0,5% sau mai mica;
    b) nu apar rezultate fals-pozitive. Daca aceasta conditie nu este indeplinita, orice proba pentru care s-a obtinut un rezultat pozitiv trebuie analizata prin metoda de referinta;
    c) cazeina din laptele de vaca trebuie sa poata fi detectata cu sensibilitatea ceruta chiar si dupa perioade lungi de maturare, asa cum se poate intampla in conditii comerciale normale. Daca aceasta conditie nu este indeplinita pentru un anumit tip de branza mentionat la pct. 1, branza respectiva trebuie analizata prin metoda de referinta.

    II. Descrierea metodei

    1. Obiect
    Detectarea laptelui de vaca si a cazeinei in branzeturile produse din lapte de oaie, lapte de capra, lapte de bivolita sau din amestecuri de lapte de oaie, capra si bivolita prin focalizarea izoelectrica a gama-cazeinelor dupa plasminoliza

    2. Domeniu de aplicare
    Prezenta metoda poate fi folosita pentru detectarea sensibila si specifica a laptelui de vaca si a cazeinatului natural sau tratat termic in branzeturile proaspete si maturate produse din lapte de oaie, lapte de capra, lapte de bivolita sau din amestecuri de lapte de oaie, capra si bivolita. Nu poate fi folosita pentru detectarea falsificarii laptelui si a branzei cu concentrate de proteine de zer de vaca tratate termic.

    3. Principiu
    3.1. Izolarea cazeinei din branza si din probele de referinta
    3.2. Dizolvarea cazeinelor izolate si tratarea acestora prin clivare plasminica (EC.3.4.21.7)
    3.3. Focalizarea izoelectrica a cazeinelor tratate cu plasmina in prezenta ureii si colorarea proteinelor
    3.4. Evaluarea benzilor colorate de gama2- si gama3-cazeina (dovezi ale prezentei laptelui de vaca) prin compararea benzilor obtinute din proba cu benzile obtinute pe acelasi gel din probele de referinta continand 0% si 1% lapte de vaca.

    4. Reactivi
    In afara cazurilor mentionate explicit, produsele chimice obtinute trebuie sa fie de puritate analitica. Apa folosita trebuie sa fie bidistilata sau de o puritate echivalenta.
    Observatie: Urmatoarele detalii se aplica gelurilor de poliacrilamide cu continut de uree preparate in laborator, cu dimensiunile de 265 x 125 x 0,25 mm. Daca se folosesc geluri de alte dimensiuni sau tipuri, se poate dovedi necesara schimbarea conditiilor de separare.

    Focalizarea izoelectrica
    4.1. Reactivi pentru producerea gelurilor de poliacrilamide cu continut de uree
    4.1.1. Prepararea solutiei "de baza" de gel
    Se dizolva in apa:
    4,85 g acrilamida
    0,15 g N, N'-metilen-bis-acrilamida (BIS)
    48,05 g uree
    15,00 g glicerina (87% m/m)
si se completeaza cu apa pana la 100 ml, apoi se pastreaza produsul obtinut in frigider, intr-un recipient din sticla de culoare inchisa.
    Observatie: In locul cantitatilor fixe de acrilamide neurotoxice mentionate mai sus se poate folosi o solutie de acrilamida/BIS prefabricata care poate fi gasita in comert. Daca o astfel de solutie contine 30% m/v acrilamida si 0,8% m/v BIS, cantitatile de acrilamida si BIS din preparatul de mai sus se inlocuiesc cu 16,2 ml de solutie. Termenul de valabilitate a solutiei "de baza" este de maximum 10 zile; daca conductibilitatea acesteia este mai mare de 5 micro S, se deionizeaza substanta prin agitare cu 2 g Amberlite MB-3 timp de 30 de minute, apoi se filtreaza printr-o membrana de 0,45 micrometri.
    4.1.2. Solutia de gel
    Se prepara o solutie de gel amestecandu-se aditivii si amfolitii cu solutia "de baza" de gel (vezi pct. 4.1.1):
    9,0 ml solutie "de baza"
    24 mg beta-alanina
    500 microlitri amfolit pH 3,5 - 9,5*1)
    250 microlitri amfolit pH 5 - 7*1)
    250 microlitri amfolit pH 6 - 8*1)
    Se amesteca solutia de gel si se degazeifica timp de doua sau trei minute intr-o baie cu ultrasunete sau sub vid.
------------
    *1) Produsele Ampholine@ pH 3,5 - 9,5 (Pharmacia) and Resolyte@ pH 5 - 7 si pH 6 - 8 (BDH, Merck) s-au dovedit deosebit de folositoare pentru obtinerea gradului necesar de separare a gama-cazeinelor.

    Observatie: Solutia de gel se prepara imediat inainte de a se turna (vezi pct. 6.2).
    4.1.3. Catalizatori:
    4.1.3.1. N, N, N' N' - tetrametiletilendiamina (Temed)
    4.1.3.2. 40% m/v persulfat de amoniu (PER)
    Se dizolva 800 mg PER in apa si se completeaza cu apa pana la 2 ml.
    Observatie: A se folosi intotdeauna solutie PER proaspat preparata.
    4.2. Fluid de contact: kerosen sau parafina lichida
    4.3. Solutie anodica: se dizolva in apa 5,77 g acid fosforic (85% m/m) si se dilueaza pana la 100 ml.
    4.4. Solutie catodica: se dizolva in apa 2,00 g hidroxid de sodiu si se dilueaza pana la 100 ml.

    Prepararea probei
    4.5. Reactivi pentru izolarea proteinelor
    4.5.1. Se dilueaza acid acetic (25,0 ml acid acetic glacial completat cu apa pana la 100 ml)
    4.5.2. Clorura de metilen
    4.5.3. Acetona
    4.6. Solutie tampon de dizolvare a proteinei
    Se dizolva in apa:
    5,75 g glicerina (87% m/m)
    24,03 g uree
    250 mg ditiotreitol
si se completeaza cu apa pana la 50 ml.
    Observatie: Se pastreaza substanta in frigider; termen de valabilitate: maximum o saptamana.
    4.7. Reactivi pentru clivarea plasminica a cazeinelor
    4.7.1. Solutie tampon de carbonat de amoniu
    Se titreaza pana la pH 8 o solutie de bicarbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml apa) continand acid etilendiaminotetraacetic 0,05 mol/l (EDTA, 1,46 g/100 ml), cu o solutie de carbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml apa) continand 0,05 mol/l EDTA.
    4.7.2. Plasmina bovina (EC 3.4.21.7), cu activitate de minimum 5 U/ml
    4.7.3. Solutie de acid epsilon-aminocaproic pentru inhibarea enzimelor
    Se dizolva 2,624 g acid epsilon-aminocaproic (acid 6-amino-n-hexanoic) in 100 ml de etanol 40% (v/v).
    4.8. Probe de referinta
    4.8.1. De la Institutul pentru Materiale si Masuratori de Referinta al Comunitatii, B-2440 Geel, Belgia, pot fi obtinute probe de referinta certificate, obtinute din amestecuri de lapte degresat de oaie si capra continand 0%, respectiv 1% lapte de vaca.
    4.8.2. Prepararea probelor de referinta provizorii de laborator din lapte de bivolita inchegat continand 0% si 1% lapte de vaca
    Laptele degresat se prepara prin centrifugarea laptelui crud de bivolita sau de vaca vrac la 37 grade C (2.500 g, timp de 20 de minute). Dupa racirea rapida a tubului si a continutului la 6 - 8 grade C stratul superior de grasime se indeparteaza in totalitate. Pentru prepararea probei standard 1% se adauga 5,00 ml lapte de vaca degresat la 495 ml lapte de bivolita degresat intr-un vas de 1 l, se ajusteaza pH-ul la 6,4 prin adaugarea de acid lactic diluat (10% m/v). Se ajusteaza temperatura la 35 grade C si se adauga 100 microlitri cheag de vitel (activitatea reninica 1:10000, c. 3000 U/ml), se amesteca timp de 1 minut, apoi se acopera vasul cu o folie de aluminiu si se lasa la 35 grade C timp de o ora pentru a se forma coagulul. Dupa formarea acestuia laptele inchegat este liofilizat in intregime fara omogenizare prealabila si fara a se extrage zerul. Dupa liofilizare produsul se zdrobeste pana se obtine o pulbere fina omogena. Pentru prepararea probei standard 0% se urmeaza aceeasi procedura, folosindu-se lapte degresat de bivolita veritabil. Probele trebuie pastrate la -20 grade C.
    Observatie: Inaintea prepararii probelor standard se recomanda verificarea puritatii laptelui de bivolita prin focalizarea izoelectrica a cazeinelor tratate cu plasmina.

    Reactivi pentru colorarea proteinelor
    4.9. Fixator: se dizolva in apa 150 g acid tricloroacetic si se completeaza cu apa pana la 1.000 ml.
    4.10. Solutie pentru decolorare: se dilueaza cu apa distilata pana la 2.000 ml 500 ml metanol si 200 ml acid acetic glacial.
    Observatie: Se prepara zilnic o solutie proaspata de decolorare; solutia poate fi preparata prin amestecarea de volume egale de solutii "de baza" metanol 50% (v/v) si acid acetic glacial 20% (v/v).
    4.11. Solutii pentru colorare
    4.11.1. Solutie pentru colorare (solutie "de baza" 1)
    Se dizolva 3,0 g Albastru Briliant de Coomassie G-250 (C.I. 42655) in 1.000 ml metanol 90% (v/v), folosindu-se un agitator magnetic (timp de aproximativ 45 de minute), apoi se filtreaza prin doua filtre cutate de hartie cu porozitate medie.
    4.11.2. Solutie pentru colorare (solutie "de baza" 2)
    Se dizolva 5,0 g sulfat de cupru (pentahidrat in 1.000 ml acid acetic 20% (v/v).
    4.11.3. Solutie pentru colorare (solutie de lucru)
    Se amesteca 125 ml din fiecare solutie "de baza" (pct. 4.11.1, 4.11.2) imediat inainte de colorare.
    Observatie: Se recomanda prepararea solutiei de colorare in ziua folosirii acesteia.

    5. Aparatura
    5.1. Placi de sticla (265 x 125 x 4 mm); rola de cauciuc (latime 15 cm), masa reglabila
    5.2. Foi sustinatoare de gel (265 x 125 mm)
    5.3. Foaie de acoperire (280 x 125 mm). Se lipeste o bucata de banda adeziva (280 x 6 x 0,25 mm) pe fiecare latura lunga (vezi figura 1).
    5.4. Cuva de electrofocalizare cu placa de racire (de exemplu: 265 x 125 mm) cu unitate de alimentare electrica adecvata (>/= 2,5 kV) sau cu aparat automat de electroforeza
    5.5. Criostat de circulatie reglabila la 12 +/- 0,5 grade C
    5.6. Centrifuga care poate realiza 3.000 g
    5.7. Benzi de electrozi (>/= 265 mm)
    5.8. Sticle picuratoare de plastic pentru solutiile anodice si catodice
    5.9. Aplicatoare de probe (10 x 5 mm, viscoza sau hartie de filtru cu absorbtie redusa a proteinelor)
    5.10. Foarfece, scalpele si pensete din otel inoxidabil
    5.11. Cuve din otel inoxidabil pentru colorare si decolorare (de exemplu: tavi de 280 x 150 mm)
    5.12. Omogenizator ajustabil cu tija (diametrul tijei 10 mm), viteza de rotatie 8.000 - 20.000 rpm
    5.13. Agitator magnetic
    5.14. Baie cu ultrasunete
    5.15. Aparat de sudura a foliilor
    5.16. Micropipete de 25 microlitri
    5.17. Concentrator sub vid sau liofilizator
    5.18. Baie de apa cu agitator, reglabila si care poate realiza 35 si 40 +/- 1 grade C
    5.19. Echipament de densitometrie cu citire la lambda = 634 nm

    6. Procedura de testare
    6.1. Prepararea probei
    6.1.1. Izolarea cazeinelor
    Se cantareste intr-un tub de centrifuga de 100 ml echivalentul a 5 g materie uscata de branza sau proba de referinta, se adauga 60 ml apa distilata si se omogenizeaza cu un omogenizator cu tija (8.000 - 10.000 rpm). Se ajusteaza la un pH de 4,6 cu o solutie de acid acetic diluat (pct. 4.5.1) si se pune in centrifuga (5 minute, 3.000 g). Se decanteaza grasimea si zerul, se omogenizeaza reziduul la 20.000 rpm in 40 ml apa distilata ajustata la un pH de 4,5 cu solutie de acid acetic diluat (pct. 4.5.1), se adauga 20 ml diclorometan (pct. 4.5.2), se omogenizeaza din nou si se pune in centrifuga (5 minute, 3.000 g). Se indeparteaza cu o spatula stratul de cazeina care se afla intre faza apoasa si cea organica (vezi figura 2) si se elimina ambele faze. Se reomogenizeaza cazeina in 40 ml apa distilata (vezi mai sus) si in 20 ml diclorometan (pct. 4.5.2), apoi se pune in centrifuga. Se repeta procedura pana cand ambele faze extrase sunt incolore (de doua sau trei ori). Se omogenizeaza reziduul de proteina cu 50 ml acetona (pct. 4.5.3) si se filtreaza printr-un filtru cutat cu hartie de porozitate medie. Se spala de fiecare data reziduul de pe filtru cu cate doua portii separate de 25 ml acetona si se lasa sa se usuce in aer sau in curent de azot, apoi se transforma in pulbere intr-un mojar.
    Observatie: Cazeina izolata uscata trebuie pastrata la -20 grade C.
    6.1.2. Clivarea plasminica a beta-cazeinelor pentru intensificarea gama-cazeinelor
    Se prepara o suspensie de 25 mg cazeine izolate (pct. 6.1.1) in 0,5 ml solutie tampon de carbonat de amoniu (pct. 4.7.1) si se omogenizeaza timp de 20 de minute, folosindu-se, de exemplu, tratamentul ultrasonic. Se incalzeste la 40 grade C si se adauga 10 microlitri plasmina (pct. 4.7.2), apoi se amesteca si se incubeaza timp de o ora la 40 grade C, agitand incontinuu. Pentru a inhiba enzimele se adauga 20 microlitri solutie de acid epsilon-aminocaproic (pct. 4.7.3), apoi se adauga 200 mg uree solida si 2 mg ditiotreitol.
    Observatie: Pentru a obtine o simetrie mai mare a benzilor cazeinice focalizate se recomanda liofilizarea solutiei dupa adaugarea acidului epsilon-aminocaproic si dizolvarea reziduurilor in 0,5 ml solutie tampon pentru dizolvarea proteinelor (pct. 4.6).
    6.2. Prepararea gelurilor poliacrilamide care contin uree
    Cu ajutorul catorva picaturi de apa se intinde foaia sustinatoare de gel (pct. 5.2) pe o placa de sticla (pct. 5.1), indepartandu-se surplusul de apa cu un servetel. Se intinde in mod similar foaia de acoperire (pct. 5.3) cu spatiatoare (0,25 mm) pe o alta placa de sticla. Se asaza placa orizontal pe masa reglabila.
    Se adauga 10 microlitri Temed (pct. 4.1.3.1) la solutia de gel degazeificata pregatita (pct. 4.1.2), se amesteca si se adauga 10 microlitri solutie PER (pct. 4.1.3.2), se amesteca bine si se toarna imediat amestecul intr-un strat egal pe centrul foii de acoperire. Se pune o margine a placii sustinatoare de gel (cu fata foii indreptata in jos) pe placa de acoperire si se coboara incet, astfel incat intre foi sa se formeze un strat subtire de gel care sa se intinda uniform si fara bule (figura 3). Se coboara cu grija pana la capat placa sustinatoare de gel, folosindu-se o spatula subtire, apoi se asaza inca trei placi de sticla deasupra, pentru a actiona ca greutate. Dupa incheierea polimerizarii (in jur de 60 minute) se transfera gelul polimerizat impreuna cu foaia de acoperire pe foaia sustinatoare de gel, inclinandu-se placile de sticla. Se curata cu grija spatele foii sustinatoare de gel pentru a se elimina reziduurile de gel si de uree. Se sudeaza marginile "sandvisului" de gel astfel incat sa se obtina un tub si se pastreaza in frigider (timp de maximum 6 saptamani).
    Observatie: Foaia de acoperire si spatiatoarele pot fi refolosite. Gelul de poliacrilamida poate fi taiat la dimensiuni mai mici, actiune care este recomandata in cazul in care exista putine probe sau daca se foloseste un aparat automat de electroforeza (doua geluri format 4,5 x 5 cm).
    6.3. Focalizarea izoelectrica
    Se regleaza termostatul de racire la 12 grade C. Se sterge cu kerosen spatele foii sustinatoare de gel, apoi se picura cateva picaturi de kerosen (pct. 4.2) pe centrul blocului de racire. Se ruleaza apoi pe el "sandvisul" de gel, cu partea sustinatoare de gel indreptata in jos, avandu-se grija sa se evite formarea bulelor. Se sterge excesul de kerosen si se indeparteaza foaia de acoperire. Se imbiba benzile de electrozi in solutiile electrolitice (pct. 4.3, 4.4), se taie dupa lungimea gelului si se plaseaza in pozitia prevazuta (distanta dintre electrozi de 9,5 cm).

    Conditii pentru focalizarea izoelectrica:
    6.3.1. Dimensiunile gelului 265 x 125 x 0,25 mm
________________________________________________________________________________
       Pas                Timp   Voltaj         Intensitate Putere     Volti ora
                          (min.) (V)            (mA)        (W)        (Vh)
________________________________________________________________________________
1. Prefocalizare          30     maximum 2.500  maximum 15  constant 4 c. 300
________________________________________________________________________________
2. Focalizarea probei*1)  60     maximum 2.500  maximum 15  constant 4 c. 1000
________________________________________________________________________________
3. Focalizarea finala     60     maximum 2.500  maximum 5   maximum 20 c. 3000
                          40     maximum 2.500  maximum 6   maximum 20 c. 3000
                          30     maximum 2.500  maximum 7   maximum 25 c. 3000
________________________________________________________________________________
    *1) Aplicarea probei: dupa prefocalizare (pasul 1) se picura 18 microlitri din proba si din solutiile standard pe aplicatorii probei (10 x 5 mm), se plaseaza aplicatorii pe gel la distanta de 1 mm unul de celalalt si la 5 mm longitudinal fata de anod si se apasa usor. Procedura de focalizare se finalizeaza in conditiile specificate mai sus, indepartandu-se cu grija aplicatorii probei dupa 60 de minute de focalizare a probei.

    Observatie: Daca se schimba grosimea sau latimea gelurilor, atunci intensitatea si puterea curentului trebuie ajustate in consecinta (e.g. daca se foloseste un gel de 265 x 125 x 0,5 mm se dubleaza valorile pentru intensitatea si puterea curentului electric).
    6.3.2. Exemplu de program de voltaj pentru un aparat automat de electroforeza (doua geluri de 5,0 x 4,5 cm), cu electrozi fara benzi si aplicati direct pe gel
_____________________________________________________________________________
         Pas             Voltaj  Intensitate  Putere  Temperatura  Volti ora
_____________________________________________________________________________
1. Prefocalizare        1.000 V    10,0 mA     3,5 W   8 grade C    85 Vh
_____________________________________________________________________________
2. Focalizarea probei     250 V     5,0 mA     2,5 W   8 grade C    30 Vh
_____________________________________________________________________________
3. Focalizare           1.200 V    10,0 mA     3,5 W   8 grade C    80 Vh
_____________________________________________________________________________
4. Focalizare           1.500 V     5,0 mA     7,0 W   8 grade C   570 Vh
_____________________________________________________________________________

    Se plaseaza aplicatorul probei la pasul 2 la 0 Vh.
    Se indeparteaza aplicatorul probei la pasul 2 la 30 Vh.
    6.4. Colorarea proteinelor
    6.4.1. Fixarea proteinelor
    Se indeparteaza benzile de electrozi imediat dupa stingerea aparatului si se plaseaza imediat gelul intr-o cuva de colorare/decolorare umpluta cu 200 ml fixator (pct. 4.9); se lasa acolo timp de 15 minute, agitand continuu.
    6.4.2. Spalarea si colorarea placii de gel
    Se scurge cu grija fixatorul si se spala placa de gel de doua ori, timp de cate 30 de secunde, cu 100 ml solutie decoloranta (pct. 4.10). Se decanteaza solutia decoloranta si se umple cuva cu 250 ml solutie coloranta (pct. 4.11.3); se lasa 45 de minute sa se coloreze, agitandu-se usor cuva.
    6.4.3. Decolorarea placii de gel
    Se decanteaza solutia coloranta, se spala placa de gel de doua ori, cu cate 100 ml solutie decoloranta (pct. 4.10), apoi se agita timp de 15 minute cu 200 ml solutie decoloranta si se repeta pasul de decolorare de cel putin doua-trei ori, pana cand fundul vasului este curatat si incolor. Se clateste apoi cu apa distilata placa de gel (2 x 2 minute) si se usuca la aer (2 - 3 ore) sau cu un uscator de par (10 - 15 minute).
    Observatie 1: Fixarea, spalarea, colorarea si decolorarea se efectueaza la 20 grade C. A nu se folosi temperaturi ridicate.
    Observatie 2: Daca se prefera colorarea mai sensibila cu argint (e.g. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, cod nr. 17-1150-01), probele de cazeina tratate cu plasmina trebuie diluate la 5 mg/ml.

    7. Interpretarea rezultatelor
    Evaluarea este efectuata prin compararea benzilor de proteine ale probei necunoscute cu probele de referinta efectuate pe acelasi gel. Detectarea laptelui de vaca in branzeturile din lapte de oaie, lapte de capra si lapte de bivolita si in amestecurile de lapte de oaie, capra si bivolita se face prin intermediul gama3- si gama2-cazeinelor, ale caror puncte izoelectrice se afla in intervalul pH 6,5 - 7,5 (figurile 4a, 4b si 5). Limita de detectie este mai mica de 0,5% .
    7.1. Interpretare vizuala
    Pentru evaluarea vizuala a cantitatii de lapte de vaca se recomanda ajustarea concentratiilor probelor si a probelor standard pentru a se obtine acelasi nivel de intensitate a gama3- si gama2-cazeinelor din laptele de ovine, caprine si/sau bivolite (vezi "gama2-E, G, B" si "gama3-E, G, B" din figurile 4a, 4b si 5). Dupa aceasta nivelul de lapte de vaca (mai mic decat, egal cu sau mai mare de 1%) din proba necunoscuta poate fi estimat direct, prin compararea intensitatii gama3- si gama2-cazeinelor din laptele de vaca (vezi "gama3-C" si "gama2-C" din figurile 4a, 4b si 5) cu cea a probelor de referinta de 0% si 1% (oaie, capra) sau cu standardele provizorii de laborator (bivolita).
    7.2. Interpretare densitometrica
    Daca este disponibila, se aplica densitometria (pct. 5.19) pentru determinarea raportului dintre suprafata varfurilor gama3- si gama2-cazeinelor din laptele de vaca, respectiv din laptele de oaie, capra si/sau bivolita (vezi figura 5). Aceasta valoare se compara cu raportul dintre suprafata varfurilor gama3- si gama2-cazeinelor pentru proba de referinta 1% (oaie, capra) sau pentru standardul provizoriu de laborator (bivolita), analizate pe acelasi gel.
    Observatie: Metoda functioneaza corespunzator daca se obtine un semnal pozitiv clar pentru ambele cazeine gama3- si gama2- din proba de referinta 1%, dar nu si din proba de referinta 0% . Daca nu, procedura trebuie imbunatatita respectandu-se cu exactitate detaliile acestei metode.
    O proba este considerata pozitiva daca ambele cazeine bovine gama3- si gama2- sau raportul suprafetei varfurilor corespunzator sunt mai mari sau egale cu nivelul din proba de referinta 1% .

    Figura 1. Schita foii de acoperire.

    Figura 1, reprezentand schita foii de acoperire, se gaseste in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, nr. 236 din 7 aprilie 2003, la pagina 28.

    Figura 2. Strat de cazeina plutind intre faza apoasa si faza organica.

    Figura 2, reprezentand stratul de cazeina plutind intre faza apoasa si faza organica, se gaseste in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, nr. 236 din 7 aprilie 2003, la pagina 28.

    Figura 3. Tehnica de pliere pentru obtinerea filmului de gel.
    a - banda adeziva pentru spatiere (0,25 mm)
    b - foaie de acoperire (5.3)
    c, e - placi de sticla (5.1)
    d - solutie de gel (4.1.2)
    f - foaie sustinatoare de gel (5.2)

    Figura 3, reprezentand tehnica de pliere pentru obtinerea filmului de gel, se gaseste in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, nr. 236 din 7 aprilie 2003, la pagina 28.

    Figura 4a. Focalizare izoelectrica a cazeinelor tratate cu plasmina din branza provenita din lapte de oaie si de capra, continand diferite cantitati de lapte de vaca.
    % CM = procent de lapte de vaca
    C = vaca; E = oaie; G = capra.
    Este ilustrata jumatatea de sus a gelului.

    Figura 4a, reprezentand focalizarea izoelectrica a cazeinelor tratate cu plasmina din branza provenita din lapte de oaie si de capra, continand diferite cantitati de lapte de vaca, se gaseste in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, nr. 236 din 7 aprilie 2003, la pagina 29.

    Figura 4b. Focalizare izoelectrica a cazeinelor tratate cu plasmina din branza provenita din amestec de lapte de oaie, capra si bivolita, continand diferite cantitati de lapte de vaca.
    % CM = procent de lapte de vaca
    1+ - proba continand 1% lapte de vaca si dopata cu cazeina pura bovina la mijlocul traiectului gelului
    C = vaca; E = oaie; G = capra.
    Este ilustrata distanta totala de separare a gelului IEF.

    Figura 4b, reprezentand focalizarea izoelectrica a cazeinelor tratate cu plasmina din branza provenita din amestec de lapte de oaie, capra si bivolita, continand diferite cantitati de lapte de vaca, se gaseste in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, nr. 236 din 7 aprilie 2003, la pagina 29.

    Figura 5. Suprapunerea densitogramelor probelor standard (STD) si a probelor preparate din amestec de lapte de oaie si de capra dupa focalizare izoelectrica.
    a, b - probe standard continand 0 si 1% lapte de vaca;
    c - g - probe de branza continand 0, 1, 2, 3 si 7% lapte de vaca.
    C = vaca; E = oaie; G = capra.
    Jumatatea superioara a gelului IEF a fost scanat la lambda = 634 nm.

    Figura 5, reprezentand suprapunerea densitogramelor probelor standard (STD) si a probelor preparate din amestec de lapte de oaie si de capra dupa focalizare izoelectrica, se gaseste in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, nr. 236 din 7 aprilie 2003, la pagina 30.